장내 마이크로바이옴은 숙주의 생리를 형성하는 데 중요한 역할을 합니다. 특히 이 프로토콜은 단일 세포 동물에서 형광 장내 미생물 집락화 수준을 대규모로 고처리량으로 평가할 수 있습니다. 이 방법의 주요 이점 중 하나는 살아있는 동물의 장내 마이크로바이옴을 실시간으로 모니터링할 수 있다는 것인데, 이를 통해 숙주의 생리학에 따른 변화를 식별하고 상관 관계를 파악할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 사람은 내 실험실의 연구원인 Dana Blackburn입니다. 박테리아 잔디밭에서 벌레를 1-2 밀리리터의 M9-TX로 씻어내는 것으로 시작하십시오. 웜을 멸균 된 2 밀리리터 96 웰 깊이의 플레이트로 옮깁니다.
300G에서 1분 동안 펠릿화하고 흡입 매니폴드를 사용하여 액체를 제거합니다. 1.2 밀리리터 멀티 채널 피펫을 사용하여 1.8 밀리리터의 M9-TX를 피펫팅으로 혼합된 딥 웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 300G에서 1분 동안 원심분리합니다. 최종 세척 후 흡인 매니폴드를 사용하여 각 웰의 부피를 100마이크로리터로 가져옵니다.
100 마이크로 리터의 10 밀리 몰 레바미솔과 M9-T를 각 웰에 넣고 벌레가 5 분 동안 마비되도록합니다. 그런 다음 박테리아 덩어리를 줄이기 위해 2분 동안 각 웰에 4% 표백제 용액을 추가합니다. 표백제 처리 후 M9-TX를 플레이트의 각 웰에 추가하여 벌레를 씻습니다.
플레이트를 원심 분리하고 두 번째 세척 후 최종 부피 100 마이크로 리터까지 흡인합니다. 웜을 150 마이크로 리터의 10 밀리몰의 레바미솔과 M9-TX를 포함하는 평평한 바닥 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 웜 밀도를 우물 당 50-100 마리의 웜으로 유지하고 개체군이 너무 붐비면 웜을 여러 개의 우물로 나눕니다.
공기 압축기, 컴퓨터 및 LPS 기기를 켭니다. 폐기물 탱크를 확인하고 비우십시오. 양이 적으면 덮개와 물 탱크를 확인하고 다시 채우십시오.
250마이크로미터의 유체 및 광학 코어 어셈블리가 제자리에 있는지 확인합니다. 오토샘플러를 연결하고 켭니다. 오토샘플러 기기 소프트웨어를 열어 오토샘플러와 LPS 소프트웨어를 엽니다.
LPS 소프트웨어 창에서 파일로 이동하여 새 실험을 클릭한 다음 파일을 다시 선택하고 새 샘플 검사를 클릭합니다. 레이저가 488 및 561 나노미터 레이저를 켤 수 있도록 합니다(아직 수행되지 않은 경우). 이제 LPS 소프트웨어 창에서 ToF(Time of Flight), 소광(extinction) 및 형광 채널(fluorescent channel)을 사용하여 획득 도트 플롯을 위한 템플릿을 만들 수 있습니다.
그래프 본문 내에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 배율을 수정합니다. 다음으로, 대조군 샘플을 불러옵니다. 자동 샘플러 창에서 prime을 선택하고 파일로 이동한 다음 스크립트 열기를 클릭하여 올바른 기본 제공 스크립트를 선택하고 확인을 클릭합니다.
샘플러 소프트웨어 메뉴의 플레이트 템플릿으로 이동하여 분석을 위해 원하는 웰을 선택합니다. 플레이트를 오토샘플러 스테이지에 로드하고 고정한 후 오토샘플러 창에서 플레이트 실행을 누르고 메시지가 표시되면 파일을 저장한 다음 LPS 소프트웨어 창의 상단 리본에 있는 현재 데이터 저장 버튼을 클릭하고 데이터를 다시 저장합니다. LPS 소프트웨어를 엽니다.
파일로 이동하여 새 실험을 선택한 다음, 파일로 돌아가서 새 샘플을 클릭합니다. X축에 비행 시간(time of flight)이 표시되고 Y축에 소멸(extinction)이 있는 점도표를 만듭니다. X축에 ToF(Time of Flight)가 있고 Y축에 빨간색이 있는 또 다른 점도표를 만듭니다.
레이저가 488 및 561 나노미터 레이저를 활성화할 수 있도록 활성화를 선택해야 합니다. control sample tube를 샘플 포트에 배치한 다음, acquire and dispense 대화 상자 내에서 acquire를 클릭합니다. 메시지가 표시되면 파일을 저장해야 합니다.
개체군을 구별할 수 있을 만큼 충분한 웜이 측정되면 비행 시간과 멸종 시간을 보여주는 점도표에서 중단을 선택합니다. 성인 인구를 나타내는 지역 주위에 게이트를 그립니다. 그런 다음 보기로 이동하여 gating hierarchy를 클릭하고 형광 게이트가 성인 인구 게이트 아래에 올바르게 나열되는지 확인합니다.
비행 시간 대 빨간색 점 그림에서 높은 값과 낮은 빨간색 영역 주위에 게이트를 만들어 성충의 마이크로바이옴 집락을 보여주는 관심 영역을 강조 표시합니다. 설정이 최적화되면 파일로 이동하여 실험 저장을 클릭한 다음 파일을 클릭하고 샘플 저장을 선택합니다. 수집 장치를 로드하려면 로드 플레이트 A를 선택하여 수집 stage는 수집 튜브 또는 96웰 플레이트를 로드할 수 있는 위치로 이동합니다.
96웰 플레이트에 디스펜싱하려면 설정 섹션으로 이동하여 플레이트를 선택한 다음 보정된 플레이트를 클릭하고 96웰 플레이트를 선택합니다. 그런 다음 웜을 정렬할 웰을 선택하고 각 웰에 정렬할 개체 수를 입력합니다. 제어된 관심 영역도 지정해야 합니다.
여러 게이트 영역이 동일한 플레이트로 정렬되는 경우 각 웰에 게이트라고 표시된 상자를 선택해야 합니다. 확인을 클릭하여 변경 사항을 저장합니다. 번호를 분류하고 위치를 할당한 후 샘플을 샘플 포트에 로드하고 획득 및 분주 대화 상자에서 주입 플레이트 버튼을 클릭하여 96웰 플레이트로 분주를 시작합니다.
더 높은 연장 및 비행 시간 값은 유충에 비해 성충에서 관찰됩니다. 생후 2일 된 성체의 자손은 L1 및 L2 단계에 의해 지배된 반면, 생후 3일 된 성체의 자손은 대부분 L3 및 L4 단계에 도달했습니다. 대장균에서 자랐을 때, 비행 시간 및 확장 값은 2일차에 비해 3일차에 증가했습니다.
ochrobactrum, BH 3 및 혼합 배양에서 자랄 때 cenor abdidas allegands는 비행 시간 및 확장 값의 차이를 보였습니다. 증가된 ochrobactrum BH3 집락화는 ochrobactrum BH3 단독에서보다 혼합 조건에서 관찰되었습니다. 대조적으로, 녹색의 형광 값은 OP50 단독보다 혼합 조건에서 OP50 집락화가 더 낮다는 것을 나타냅니다.
웜은 Y축 쪽으로 심하게 치우쳐 있어 대부분의 웜에서 OP50 군집이 낮고 ochrobactrum, BH3 군집 수준이 개체군에 고르게 분포되어 있음을 시사합니다. ochrobactrum, BH3 군집 수준과 체밀도 및 번식 패턴의 차이와 같은 숙주의 발달 사이의 관계도 관찰되었습니다. 두 구성원 혼합에서 자란 3일 된 성체는 마이크로바이옴에서 광범위한 RFP 강도를 보였으며, 이는 그룹 내 ochrobactrum 집락화의 개인차를 나타냅니다.
높은 RFP 게이트와 낮은 RFP 게이트에서 분류된 15개의 개별 웜이 포함된 웰의 RFP 이미지가 표시됩니다. 가장 중요한 것은 프로토콜과 시스템이 제대로 작동하는지 확인하기 위해 모든 단계에 적절한 컨트롤을 사용하는 것을 기억하는 것입니다. 실시간으로 특정 특징을 가진 동물을 사용하여 숙주 또는 미생물 돌연변이 풀에서 균주를 분리하여 미생물 후 상호 작용을 조절하는 유전자를 식별할 수 있습니다.
분리된 동물은 또한 단일 동물 또는 RNA-seq 등과 같은 농축된 표현형 풀 기반 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 정말로, 기회는 정말 무궁무진합니다.
