이 프로토콜은 모델 유기체 인 C.elegans에서 종단 및 전사 분석의 조합을 사용하여 두 가지 지질 보충 전략을 설명합니다. 이 기술은 소수의 벌레 또는 해부 된 벌레 조직을 사용하여 전사 변화를 검사하는 방법과 벌레 개체군에 대한 액체 공급이 수력 기술과 결합 될 수있는 방법을 설명합니다. 이 기술을 수행하는 개인은 적절한 전사 분석을 달성하기 위해 실험을 수행하는 짧은 시간 때문에 조직 해부를 연습해야 합니다.
우선, 하룻밤 성장한 배양물을 실온에서 10분 동안 4, 000 G에서 원심분리하여 OP50 박테리아를 수집한다. 상청액을 폐기하십시오. 박테리아 펠렛을 20 밀리리터의 박테리아 희석, 식이 제한 또는 BDR 베이스에 와동에 의해 현탁시키고 다시 10분 동안 원심분리를 반복한다.
상청액을 버린 후, 박테리아 펠렛을 BDR 배지에 재현탁시켜 20 X BDR 박테리아 스톡을 제조하였다. 사용하기 전에 BDR 배지를 사용하여 박테리아 스톡을 5X로 희석하십시오. 에탄올 또는 디메틸 황산 시드를 용매로 사용하여 새로운 오토 클레이브 유리 바이알에 지질 원액을 준비하고 유리 바이알에 아르곤 또는 질소를 채워 산화를 방지합니다.
지질 스톡 용액을 BDR 박테리아 용액으로 옮겨 공급 조건에서 원하는 최종 농도를 달성합니다. 20 초 동안 소용돌이 치면서 철저히 혼합하십시오. 동일한 부피의 여과된 에탄올 또는 디메틸 설폭사이드를 BDR 박테리아와 혼합함으로써 대조군 비히클을 준비한다.
원하는 양의 지질 또는 비히클 대조군을 각 공급 조건에 대해 3-4회 반복하여 12웰 플레이트의 각 웰로 옮겨 지질 보충 및 액체 배양을 수행합니다. 동기화 된 Caenorrhabditis elegans 웜 현탁액을 5X BDR 박테리아와 일대일 비율로 혼합하여 밀리리터 당 1, 500 웜 및 박테리아의 경우 2.5X의 최종 농도를 달성하십시오. 그런 다음 2 밀리리터의 웜 박테리아 혼합물을 12 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
완료되면 12웰 플레이트를 호일로 감싸고 원하는 배양 길이에 대해 섭씨 20도의 100RPMM에서 플레이트를 흔듭니다. 플레이트에 지질 보충을 위해 10cm 선충 성장 배지 또는 NGM 한천 플레이트의 중앙에 지질 조절 박테리아 1mg을 씨를 뿌립니다. 많은 수의 플레이트로 작업할 때 두 플레이트를 시드하는 사이에 최종 작업 솔루션이 여러 번 소용돌이되는지 확인합니다.
생물 안전 후드 내부의 어두운 곳에서 플레이트를 건조시킵니다. 동기화 된 웜 배양에서 3000 개의 웜을 10cm 플레이트로 옮깁니다. 지질 보충 판에서 수영하고 있던 벌레가 크롤링을 시작할 때까지 생물 안전 후드에서 판을 건조시킵니다.
일단 건조되면, 지질 컨디셔닝 플레이트를 섭씨 20도 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 배양하고, 고도불포화 지질을 사용하는 경우 플레이트를 빛으로부터 보호한다. PCR 튜브에서 0.2마이크로리터의 DNase I과 19.8마이크로리터의 용해 용액을 혼합하여 각 샘플에 대해 20마이크로리터의 최종 용해 용액을 준비하고 5회 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 소수의 전체 벌레에서 RNA를 추출하려면 박테리아 잔디에서 15-20 개의 벌레를 새로 파종되지 않은 NGM 플레이트로 옮겨 박테리아를 제거하십시오.
파종되지 않은 NGM 플레이트에서 15 내지 20 웜을 최소 수의 박테리아로 새로 준비된 최종 용해 용액 20 마이크로리터가 들어 있는 PCR 튜브로 옮기고 용해 반응을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플을 멋진 냉수 욕조에 보관하고 프로브가 웜을 4 번, 5 초 동안 30 % 진폭으로 매번 초음파 처리하고 초음파 처리 시간 사이에 15 초 동안 펄스합니다. 용해 반응에 2 마이크로 리터의 정지 용액을 추가하기 전에 튜브를 실온에서 5 분 동안 배양하고 부드럽게 두드려 혼합합니다.
반응물을 실온에서 2분 동안 배양한 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 벌레 조직에서 RNA를 추출하려면 박테리아 잔디에서 약 20 개의 벌레를 골라 씨를 뿌리지 않은 신선한 NGM 플레이트에 넣어 벌레에서 박테리아를 제거합니다. 가능한 한 적은 박테리아로 20 개의 벌레를 4 개의 마이크로 몰 levamisole을 함유 한 500 마이크로 리터의 M9 용액이 들어있는 시계 유리에 옮깁니다.
벌레가 고정되면 1 밀리리터 주사기에 부착 할 수있는 25 게이지 바늘을 사용하여 생식선 또는 장을 해부합니다. 오토클레이브 유리 피펫을 사용하여 해부된 조직을 PCR 튜브로 옮기고 튜브를 2분 동안 얼음에 침전시켜 바닥에 물질이 증착되도록 합니다. 20 마이크로 리터의 최종 용해 용액을 추가하기 전에 PCR 튜브에서 상청액을 제거하고 두드려 잘 혼합하십시오.
용해 반응을 5분 동안 배양한 후 2마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 튜브를 여러 번 두드립니다. 역전사를 진행하기 전에 튜브를 2분 동안 배양합니다. 검증 연구에서 많은 집단과 소수의 벌레에서 추출한 RNA는 신경 펩티드 처리 유전자 인 egl-3 및 egl-21의 유사한 유도를 보여주었습니다.
이는 소수의 웜에서 추출한 RNA가 대규모 개체군의 표준 CDNA 합성 기술에 대한 유효한 대안이 될 수 있음을 시사합니다. 디호모-감마-리놀렌산 또는 DGLA가 보충된 lipl-4 전이유전자 웜의 해부된 장에서 뉴런 뉴로펩타이드 처리 유전자는 유도되지 않았습니다. 다양한 농도의 DGLA 보충제는 fat-3 녹다운 시 웜의 수명 연장을 구했습니다.
지질 보충제가 있는 웜은 RNA 시퀀싱, 단백질체학, 대사체학 및 행동 연구를 위해 처리되어 이러한 특정 조건에서 추가 표현형을 식별할 수도 있습니다. 이 방법론은 노화 연구, 지질 생물학 및 특정 표현형과 영양 인자 또는 대사 산물 간의 관계를 확립하는 것을 목표로하는 기타 연구 분야에 적용될 수 있습니다.
