폴리글루타민 응집을 평가하고 높은 처리량 응용 분야에 사용할 수 있는 프레임워크를 제공함으로써 프로테오스타시스의 변화를 모니터링하기 위한 간단한 접근법이 취해졌습니다. 나에 의해 집계의 수와 같은 표현형을 채점하는 것은 주관적이 될 수 있다. 집계 카운팅을 자동화하면 이러한 편향을 제거하고 처리량과 재현성을 높일 수 있습니다.
이 방법은 숙주 프로테오스타시스 파괴에 기여하는 박테리아 유전자를 확인하는 데 도움이 된다. 개별 박테리아 유전자 기여도를 이해하면 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 헌팅턴과 같은 질병의 발병기전에서 그 의미를 이해하는 데 도움이됩니다. 먼저 냉동실에서 웜이 들어있는 플레이트를 제거하고 실온에서 해동시킵니다.
그런 다음 이미징하기 전에 과도한 결로를 닦아내고 뚜껑을 제거하십시오. 노출 시간 500밀리초, 0.63 X 카메라 어댑터로 40 X 배율, 이미지 캡처 중에 GFP 강도를 100%로 설정한 현미경 설정을 사용합니다. 이제 웜이 어두운 배경과 비교하여 밝게 비춰질 때까지 전송 된 조명 컨트롤을 조정하여 과다 노출을 피하십시오.
우물 내의 웜의 위치를 변경하여 10 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 웜을 원하는 위치로 부드럽게 밀어 넣어 과도한 덩어리를 방지하십시오. 채널을 GFP 필터로 설정하여 두 이미지 모두에 대한 초점 평면을 설정합니다. 밝은 필드 이미지를 캡처합니다.
플레이트를 방해하거나 현미경의 초점을 변경하지 않고 상응하는 형광 이미지를 촬영하십시오. 이제 이미지를 평가하려면 먼저 CellProfiler를 다운로드하십시오. 소프트웨어를 열고 관심 있는 이미지를 이미지 상자에 끌어다 놓습니다.
파일 목록에서 이미지를 클릭하여 엽니다. 돋보기 유리를 선택하여 관심 영역을 강조 표시하고 화살표 아이콘을 선택하여 웜과 응집체의 길이를 측정합니다. 원하는 오브젝트 위로 마우스를 가져가면 화면 하단에서 볼 수 있는 강도 값을 결정합니다.
CellProfiler 이미지 분석 파이프라인을 활용하려면 공식 웹 사이트에서 CellProfiler를 다운로드한 후 텍스트 원고에 설명된 대로 이미지 쌍의 이름을 올바르게 지정합니다. 파이프라인을 다운로드하고 파일에서 파일, 가져오기 및 파이프라인을 선택하여 CellProfiler에 업로드합니다. 얽히지 않은 웜 모듈을 선택하여 설정을 열어 얽히지 않은 웜 모듈에서 웜을 식별하는 데 사용되는 교육 세트를 로드합니다.
그런 다음 학습 집합 파일 이름을 식별합니다. 파일 업로드 아이콘을 선택하고 보충 파일도 업로드하십시오. 왼쪽 상단 모서리에 있는 이미지 모듈을 선택하여 이미지를 업로드합니다.
그런 다음 제대로 명명 된 이미지를 끌어다 놓습니다. 이미지를 분석하기 전에 프로그램의 왼쪽 하단 모서리에있는 출력 설정 버튼을 클릭하여 결과를 저장하는 데 사용할 원하는 출력 폴더를 선택하십시오. 그런 다음 기본 출력 오른쪽의 폴더 아이콘을 선택하여 원하는 출력 위치를 선택하십시오.
이미지 분석 아이콘을 선택하여 이미지 분석을 시작합니다. 분석을 완료하는 데 너무 오래 걸리고 단일 이미지를 처리하는 데 멈춘 경우 실행을 중단하고 출력 폴더를 정렬하고 찾을 수 없는 이미지 이름을 기록하여 처리되지 않은 이미지를 식별합니다. 완전한 분석 후, 소프트웨어는 N 열의 개별 웜과 K 열의 각 집계 수를 포함하는 Excel 스프레드 시트로 결과를 구성합니다.메타 데이터 구성 도우미를 다운로드하여 CellProfiler의 출력 CSV 파일에서 데이터를 편리하게 구성 할 수 있습니다.
Windows OS의 경우 다운로드한 파일을 찾아 원하는 위치로 압축을 풉니다. gui_Windowsos_64x이라는 이름의 추출된 폴더를 찾아 엽니다. GUI 응용 프로그램 아이콘을 클릭하여 응용 프로그램을 시작하십시오.
실행 권한을 요청하는 프롬프트가 열릴 수 있습니다. 더 많은 정보를 선택한 다음 어쨌든 실행을 클릭하십시오. 이제 메타데이터 구성 도우미가 CellProfiler 출력 CSV 파일을 끌어다 놓을 준비가 되었습니다.
Mac OS의 경우 다운로드한 파일을 찾아 파일 메타데이터 조직자 응용 프로그램 파일의 압축을 풉니다. 다운로드에서 찾을 수 있는 추출된 폴더를 엽니다. GUI 응용 프로그램을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 열기를 선택하십시오.
공식 라이센스가 없기 때문에 개봉 허가를 요청하는 프롬프트가 나타납니다. 열기를 선택합니다. 메타 데이터 주최자 응용 프로그램이 해당 OS에서 열리면 여기에 파일 업로드를 클릭하거나 원하는 CellProfiler CSV 파일을 끌어다 놓습니다.
구성 버튼을 클릭하면 파일 다운로드 버튼이있는 새 화면으로 사용자를 안내합니다. 버튼을 클릭하고 출력 파일을 저장할 원하는 위치를 선택하십시오. 출력 파일은 파일 이름에 확장명이 추가_organized 원래 파일 이름으로 나타납니다.
FUDR의 존재하에, 다양한 박테리아를 먹인 웜은 더 균일하고 정확한 웜 검출을 허용하는보다 일관된 신체 크기를 가졌으며, 따라서 과밀의 문제를 해결했습니다. 웜을 동결하면 배경 형광을 제거하여 polyQ 응집체 검출을 향상시켰을 뿐만 아니라 수동 카운팅에 필적하는 자동 계수의 정확도도 향상되었습니다. 반전된 브라이트필드 조명은 폴리Q YFP 응집체를 이미지화하기 위해 전체 C.elegans 및 GFP 채널을 검출하는데 사용되었다.
각 웜에 대한 웜 탐지, 엉킴 해제 및 집계 정량화는 최적화된 CellProfiler 이미지 처리 파이프라인을 적용하여 수행되었으며, 이를 통해 개별 웜당 집계 수를 얻을 수 있습니다. 자동화된 집계 정량화의 효능과 CellProfiler 파이프라인을 사용하는 것의 차이는 미미했으며, 이는 자동화된 방법을 대규모 스크린에 적용할 수 있음을 나타냅니다. 시험된 90개의 박테리아 균주 중에서, 하나의 후보물질을 사용한 C.elegans 장의 콜로니화는 응집체 수의 현저한 감소를 보였다.
수동 카운팅에 의한 확인 실험은 응집체의 수를 유의하게 감소시킨 돌연변이체를 포함하여 돌연변이체 중 어느 것도 polyQ 응집에 영향을 미치지 않는다는 것을 밝혀냈다. 이 프레임 워크를 사용하기로 결정한 연구원은 설명 된 단계가 절대적이지 않다는 것을 이해해야합니다. CellProfiler를 조작하는 방법에 대한 수정과 근본적인 이해는 성공을 위해 필수적입니다.
웨스턴 블롯팅과 같은 추가적인 생화학적 접근법이 폴리Q 응집을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
