시냅톤 복합체는 감수 분열의 핵심 구성 요소입니다. 그 기능을 연구하려면 초고해상도 현미경이 매우 유용한 것으로 판명된 구조도 이해해야 합니다. 우리는 면역염색된 C.elegans 생식선을 커버슬립에 안정적으로 부착하여 온전한 조직에서 분해능을 30나노미터까지 향상시키는 데 도움이 되도록 프로토콜을 최적화했습니다.
단일 분자 국소화 현미경 실험의 설계, 후속 분석 및 데이터 해석은 매우 어려울 수 있으며 전문가와 함께 설정하는 것이 가장 좋습니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 박사 전 연구원 인 Ivana Cavka가 될 것입니다. 단일 분자 국소화 현미경 이미지의 획득은 MBL 이미징 센터의 광학 엔지니어인 Rory Power도 보여줍니다.
NGM 한천 플레이트에서 연령에 맞는 Caenorhabditis elegans 벌레를 선택하는 것으로 시작하십시오. 웜을 커버 슬립에 30 마이크로 리터의 EBTT 방울로 옮깁니다. 추가 30 마이크로 리터의 EBTT로 벌레를 씻으십시오.
30 마이크로 리터의 용액을 제거하여 커버 슬립에 웜과 함께 30 마이크로 리터 방울을 남깁니다. 메스 블레이드를 사용하여 벌레의 머리 및/또는 꼬리를 잘라 생식선을 돌출시킵니다. 성공적인 해부에서 생식선 조직은 벌레 몸체 외부로 완전히 압출됩니다.
30 마이크로 리터의 고정 용액을 해부 된 벌레의 방울에 피펫 팅하십시오. 피펫팅으로 혼합하고 샘플을 1분 동안 고정하도록 둡니다. TBST로 채워진 PCR 튜브에 20 마이크로 리터 피펫을 사용하여 웜을 옮겨 정확히 1 분 후에 고정을 중지하십시오.
그런 다음 해부된 샘플을 미니 벤치탑 원심분리기에서 회전시켜 세척을 수행합니다. 상청액이 제거되면 200 마이크로 리터의 신선한 TBST에 웜을 다시 현탁시킵니다. 최종 세척 후 200 마이크로 리터의 PBST에 벌레를 다시 현탁하고 PCR 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
해부된 샘플을 미니 벤치탑 원심분리기에서 회전시키고 상청액을 제거합니다. 50 내지 100 마이크로리터의 차가운 메탄올을 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 샘플을 메탄올에 30 내지 60초 동안 얼음 위에 남겨둔다. 샘플을 200 마이크로리터의 PBST로 2회 세척한다.
샘플을 회전시키고 상청액을 제거한 후, 블로킹 용액을 샘플에 첨가하고 실온에서 45 내지 60 분 동안 유지한다. 1차 항체를 블로킹 완충액에서 작동 용액으로 희석한다. 미니 벤치탑 원심분리기에서 샘플을 스핀하여 블로킹 용액을 제거하고 30 내지 50 마이크로리터의 1차 항체 용액을 첨가한다.
섭씨 4도에서 밤새 배양하십시오. 배양의 끝에, 샘플을 PBST에서 3회 세척한다. 표지된 Fab 프라임 2개의 단편을 블로킹 완충액의 작업 용액으로 희석한다.
3차 세척 후, 샘플을 스핀다운하고, 상청액을 제거하고, 30 내지 50 마이크로리터의 2차 항체 용액을 첨가한다. 샘플을 어두운 챔버에 넣고 실온에서 30 분에서 2 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 이어서 샘플을 PBST로 5 내지 15분 동안 3회 세척한다.
염색된 샘플을 스핀다운하고 상청액을 제거합니다. 50마이크로리터의 PBST를 추가하고 염색된 벌레를 커버슬립에 옮깁니다. 5.7 내지 6.3 마이크로리터의 고정 후 용액을 폴리-l-라이신 커버슬립 상에 피펫팅한다.
해부 된 벌레를 같은 부피로 피펫팅하고 폴리 -l- 라이신 커버 슬립의 정착액 방울로 옮깁니다. 작은 커버 슬립으로 샘플을 덮으십시오. 작은 여과지를 사용하여 과도한 액체를 제거하고 어두운 챔버에서 3-5 분 동안 샘플을 고정하십시오.
샘플을 드라이 아이스의 알루미늄 블록에 올려 놓아 동결시킵니다. 최소 20분 후 면도기를 사용하여 작은 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립을 얼음처럼 차가운 PBS 또는 메탄올이 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브에 담그고 섭씨 영하 20도에서 약 10초 동안 식힙니다.
커버슬립을 PBST 버퍼로 채워진 6웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 웰로부터 PBST를 제거하고, 새로운 PBST를 첨가하고, 샘플을 5분 동안 그대로 둔다. PBST로 다시 한번 세척한 후, 이미징될 때까지 샘플을 섭씨 4도에 두십시오.
이미징하기 전에 실체 현미경으로 샘플 장착의 품질을 평가하십시오. 여기에 표시된 맞춤형 샘플 홀더를 사용하는 경우 마그네틱 링을 파라필름으로 감싸고 1밀리리터의 이미징 버퍼를 준비합니다. 6 웰 플레이트에서 커버 슬립을 가져 가십시오.
맞춤형 홀더에 넣고 파라필름으로 감싼 마그네틱 링으로 홀더에 커버슬립을 고정합니다. 샘플 상단의 마그네틱 링에 의해 생성된 챔버의 이미징 버퍼를 부드럽게 피펫팅하고 파라필름을 사용하여 챔버를 밀봉합니다. 샘플을 장착하려면 깨끗한 오일 대물렌즈에 액침 오일 한 방울을 추가합니다.
액침 오일에 공기를 넣지 않고 장착된 샘플이 있는 샘플 홀더를 현미경 스테이지에 부드럽게 놓습니다. MicroManager 2의 EMU 플러그인 창을 사용하여 초점 고정 레이저의 신호가 사분면 포토다이오드에서 감지될 때까지 피에조 스테이지를 이동합니다. 640나노미터 여기의 레이저로 저전력의 후면 초점면 이미지를 획득하여 액침 오일에 기포가 없는지 확인합니다.
명시야 조명을 사용하여 생식선 조직을 국소화합니다. 640나노미터의 저강도 조명을 사용하여 많은 시냅톤 복합체가 포함된 조직 부분에 초점을 맞춥니다. 적절한 깜박임 속도에 도달할 때까지 약 30초 동안 640나노미터의 조명과 함께 높은 방사 조도로 샘플을 노출시킵니다.
MicroManager 2의 다차원 수집 도구를 사용하여 20밀리초의 노출 시간으로 200, 000프레임을 수집합니다. 한편, 원하는 깜박임 속도를 유지하기 위해 EMU 플러그인의 활성화 옵션을 사용하여 UV 활성화를 설정하십시오. 시냅톤 복합체를 함유하는 감수 분열 핵의 최하단 평면은 HTP-3 및 SYP-5 염색을 사용하여 Caenorhabditis elegans 생식선 내에서 시각화되었다.
SYP-5 HA의 C- 말단에있는 염색체 축은 커버 슬립 가까이에 위치한 시냅 톤 복합체에서 3 차원 모두에서 잘 해결되었습니다. 그러나, 광 산란 및 구면 수차로 인해 커버 슬립으로부터 5 마이크로 미터 떨어진 곳에 위치한 시냅 톤 복합체에서는 해상도가 저하된다. 커버 슬립에서 다른 피에조 거리에서 획득 한 이미지는 이미징 된 조직이 커버 슬립에서 2 마이크로 미터 이상 떨어져 있지 않아야한다는 것을 보여주었습니다.
샘플 준비 프로토콜은 TauSTED 현미경으로도 사용할 수 있습니다. 최적화된 시료 전처리를 통해 염색체 축의 HTP-3와 중앙 영역의 SYP-5의 C-말단이 정면 보기와 약간 기울어진 보기에서 해결되었습니다. 최상의 해상도를 얻으려면 생식선을 커버 슬립에 단단히 가교하여 시냅톤 복합체가 커버 슬립에서 2 마이크로 미터를 넘지 않도록해야합니다.
당사는 이 프로토콜을 단일 분자 국소화 현미경뿐만 아니라 유도 방출 고갈 현미경에도 사용합니다. 다른 초고해상도 현미경 기술에도 유용할 수 있습니다.
