인간 환자 유래 오가노이드는 종양의 환자 다양성과 세포 이질성을 모두 나타내는 3차원 시험관 내 모델 시스템입니다. 이 프로토콜 및 비디오 데모는 환자 유래 유방 종양 및 정상 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 실습 가이드를 제공합니다. 환자 유래 유방 종양 오가노이드는 흥미로운 새로운 모델이지만 확립하기는 어렵습니다.
여기에서 제공하는 포괄적인 프로토콜은 유방 오가노이드를 개발하려는 연구자를 준비하고 예상되는 문제를 파악하는 데 도움이 될 것입니다. 다른 환자에서 파생된 모든 PDO 라인은 형태와 성장률이 독특합니다. 두 개의 2D 세포주 시스템과 달리 오가노이드는 고밀도로 도금할 때 더 잘 성장하여 더 나은 세포간 상호 작용을 가능하게 합니다.
절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 Disha Aggarwal이 될 것입니다. 시작하려면 기저막 매트릭스 한 병을 얼음 위에서 또는 섭씨 4도에서 밤새 해동하십시오. 절제된 조직을 10cm 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.
조직을 거시적으로 검사하고 형태학적으로 지방이 있거나, 혈관이 있거나, 괴사된 것처럼 보이는지 기록해 두십시오. 또한 조직의 크기와 모양을 기록하고 눈금자가 보이는 상태에서 조직 사진을 찍습니다. 멸균 번호 10 메스로 조직을 작은 조각으로 자르고 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.
밀리리터 콜라게나제 IV 용액 10 밀리리터 당 2 밀리그램을 첨가하고 튜브를 밀봉하십시오. 튜브를 섭씨 37도에서 140RPM으로 30도 각도로 90분에서 30분 동안 오비탈 셰이커에 놓습니다. 배양하는 동안 섭씨 37도에서 예열하기 위해 완전 배지의 분취량을 비드 또는 수조에 넣습니다.
15분마다, 5밀리리터의 멸균된 미리 코팅된 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 격렬하게 혼합하여 조직을 재현탁합니다. 5X 이상의 배율로 현미경으로 튜브를 관찰하여 시간 경과에 따른 해리를 모니터링했습니다. 조직이 해리되면 400G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인하고 10밀리리터의 AdDF+Again을 추가하고 조직 펠릿이 때때로 느슨해질 수 있으므로 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
조직 펠릿이 부분적으로 적색이면 2 밀리리터의 적혈구 용해 완충액을 넣고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 배양 후 10밀리리터의 AdDF+를 튜브에 넣고 400G에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 펠릿을 50 내지 300 마이크로리터의 희석되지 않은 차가운 기저막 매트릭스에 재현탁하고 기포가 형성되지 않도록 조심스럽게 피펫팅하여 혼합한다.
하룻밤 동안 인큐베이터에서 예열된 6-웰 조직 배양 플레이트를 이용하여, 각 웰에 오가노이드를 함유하는 300 마이크로리터의 기저막 매트릭스 돔을 플레이트하였다. 플레이트를 후드에 5분 동안 그대로 두었다가 섭씨 37도에서 20-30분 동안 두어 기저막 매트릭스 돔이 완전히 굳도록 합니다. 배양이 끝나면 3 밀리리터의 예열 된 완전 배지를 각 웰에 적가하고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양합니다.
배양 후 도립 명시야 현미경에서 5X 대물렌즈를 사용하여 오가노이드의 이미지를 캡처합니다. 세포 스크레이퍼 또는 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 기저막 매트릭스 돔을 웰의 배지로 들어 올립니다. 사전 코팅된 피펫 팁을 사용하여 수확되는 웰의 수에 따라 오가노이드의 플로팅 돔을 중간에 15밀리리터 또는 50밀리리터의 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 DPBS를 추가하여 부피를 최소 5 밀리리터로 늘립니다. 튜브를 400G에서 5분 동안 돌립니다. 오가노이드가 있는 기저막 매트릭스는 바닥에 층을 형성합니다.
상청액을 흡인 한 후, 튜브에 풀링 된 웰의 수에 따라 5 내지 20 밀리리터의 DPBS를 첨가한다. 오가노이드 기저막 매트릭스 펠릿을 DBPS에 미리 코팅된 멸균 일회용 피펫을 사용하여 혼합합니다. 다시, 원심분리하고 상층액을 버린다.
코팅된 피펫 팁을 사용하여 기저막 매트릭스 부피의 3배에 세포 해리 시약을 추가하고 오가노이드를 재현탁합니다. 튜브를 섭씨 37도에서 140RPM으로 8-15분 동안 비스듬한 위치로 궤도 셰이커에 놓습니다. 오가노이드가 더 작은 클러스터로 분해되는지 확인하기 위해 5분마다 현미경으로 튜브를 관찰하여 모니터링합니다.
세포 해리 시약과 피펫 이상의 부피로 AdDF+를 추가하여 오가노이드를 혼합합니다. 400G에서 5분 동안 회전시켜 오가노이드 펠릿을 얻습니다. 용해되지 않은 기저막 매트릭스가 없는 흰색 오가노이드 펠릿이 얻어지면 상층액을 버리고 펠릿을 AdDF 1밀리리터에 재현탁+AdDF+세척 단계를 위해 튜브를 돌리고 상층액을 버리십시오.
적절한 분할 비율에 따라 소화된 오가노이드에 필요한 양의 기저막 매트릭스를 추가합니다. 거품이 생기지 않도록 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 플레이트 300마이크로리터 오가노이드 돔을 미리 예열된 6웰 플레이트의 기저막 매트릭스에 재현탁합니다.
돔이 굳을 때까지 5-5 분 동안 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에 놓기 전에 플레이트를 후드에 5 분 동안 그대로 두십시오. 인큐베이션이 끝날 때, 3 밀리리터의 예열된 완전 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣는다. 5-7 일마다 신선한 완전 배지를 추가하십시오.
다양한 환자 유래 유방 종양 오가노이드 라인은 형태와 성장률이 다릅니다. C2 유래 오가노이드의 정상 유방 오가노이드와 소수의 초기 유관 암종은 정상 유방 구조와 유사했으며 중심 내강이 관 세포로 둘러싸여 있습니다. 침윤성 소엽암에서 유래한 오가노이드는 느슨하게 부착된 포도송이와 같은 구조를 형성하는 경향이 있습니다.
한편, 침윤성 유관 암종에서 파생된 오가노이드는 조밀하고 크고 둥근 오가노이드를 형성하는 경향이 있습니다. 오가노이드의 성장은 3일, 6일, 9일 및 12일에 발광 세포 생존율 분석을 사용하여 측정되었으며, 도금 후 1일째에 기준선 판독값이 측정되었습니다. 시간이 지남에 따라 확장된 동일한 오가노이드의 명시야 이미지가 여기에 표시됩니다.
일부 환자 유래 오가노이드 라인은 배가 시간이 2일인 반면 일부는 5일이 걸립니다. 확립이 느린 특정 오가노이드 라인에 인내심을 갖는 것이 중요합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 도금 밀도를 높이거나 파편을 걸러내는 것은 PDO의 성장을 촉진합니다.
환자 유래 오가노이드(PDO)는 약물 스크리닝을 위한 우수한 모델입니다. 그들은 암 병태생리학을 연구하는 데 핵심적인 세포-세포 및 세포-세포외 기질 상호작용을 모델링합니다. 또한 PDO는 유전자 조작을 거칠 수 있으며 공동 배양 시스템에서 이종 이식편을 개발하는 데 사용할 수 있어 기계론적 연구를 위한 훌륭한 모델이 됩니다.
