이 연구는 포르투갈 과학 기술 재단(FCT), 유럽 지역 개발 기금(FEDER) 및 Programa Operacional Factores de Competitividade(COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020(CIBB) 및 POCI-01-0145-FEDER-007440을 통해 국가 및 유럽 기금의 지원을 받았습니다. 저자는 코임브라 대학교 의과대학 시설이자 국가 인프라 PPBI-Portuguese Platform of BioImaging(POCI-01-0145-FEDER-022122)의 회원인 iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab의 지원과 FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142의 지원에 감사드립니다.

이 연구에서 수행된 모든 동물 절차는 코임브라 임상 및 생물 의학 연구 연구소(iCBR) 동물 복지 기구(ORBEA, #9/2018)의 승인을 받았으며 동물 관리 국가 및 유럽 지침과 ARRIVE 지침을 준수했습니다.
1. 실험 설계
<ol><li>온도(22°C ± 1°C), 습도(50%-60%) 및 빛(12시간 명암 주기)의 통제된 환경 조건에서 통풍이 잘되는 케이지에 있는 페어 하우스 13주 된 수컷 Wistar 쥐와 수돗물 및 표준 설치류 차우에 대한 임의적 접근.</li>
	<li>2 주간의 순응 기간 후, 쥐를 임의로 두 그룹으로 나눕니다.</li>
	<li>대조군(CTRL, n = 6)과 고지방 식단 그룹(HFD, n = 6)에 각각 표준 차우와 고지방 식단(45% kcal/지방)을 24주 동안 공급합니다.</li>
	<li>매주 체중(BW)을 모니터링합니다. 케이지 당 매일 음식 및 음료 소비량을 기록하십시오.</li>
</ol>2. 간 시료 전처리
<ol><li>간 해부<ol><li>연동 펌프 준비: 튜브를 통해 70% 에탄올을 흐르게 하고 27G 바늘을 튜브의 출구 끝에 연결한 다음 얼음처럼 차가운(4°C) 1x 인산염 완충 식염수(PBS, pH ~7.4)(예: 1.6mm 내경 실리콘 튜브가 있는 연동 펌프에서 200rpm, IV 미니 드립 세트). 체중을 조정합니다(예: 100-150g 쥐의 경우 약 10-12mL/분의 유속 사용).</li>
		<li>마취 프로토콜(케타민의 최종 농도 = 75mg/kg, 메데토미딘의 최종 농도 = 1mg/kg)을 사용하여 복강내 주사로 쥐를 마취합니다. 알림: 발가락 꼬집음 반응 방법을 사용하여 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.</li>
		<li>해부 트레이에 쥐를 놓습니다.</li>
		<li>70 % 에탄올로 모피를 철저히 소독하고 종이 타월로 말리십시오.</li>
		<li>가위를 사용하여 피부를 통해 "U"자 모양을 절개하고 횡격막 아래를 잘라냅니다. 그런 다음 흉곽의 가장자리를 주둥이로 잘라 심장을 노출시킵니다.</li>
		<li>1x PBS가 실행되는 동안 바늘을 좌심실을 통해 상행 대동맥으로 통과시키고 고정합니다. 그런 다음 관류가 시작되면 배액이 가능하도록 우심방을 절단합니다. 참고: 혈액이 PBS로 대체됨에 따라 간이 희미해지기 시작해야 합니다.</li>
		<li>가위와 Dumont 집게를 사용하여 간을 조심스럽게 제거하고 1x PBS로 헹굽니다.</li>
		<li>간을 페트리 접시에 옮기고 무게를 잰다.</li>
		<li>메스를 사용하여 포매 과정을 위해 간 좌엽의 측면(가장자리에서 1cm)에서 두께 5mm의 간 조직 샘플을 수집합니다. 알림: 나머지 조직은 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>간 조직 포매<ol><li>드라이아이스 용기를 준비하고 샘플 ID와 방향으로 극저온 몰드에 적절하게 라벨을 붙입니다.</li>
		<li>최적의 절단 온도(OCT)를 만들기 위해 극저온 매립 매트릭스 몇 방울을 극저온 몰드의 중앙에 놓습니다.</li>
		<li>조직 샘플이 횡단면에 대해 적절한 방향인지 확인하십시오. 알림: cryomold의 바닥에 닿는 면이 먼저 절단될 면인지 확인하십시오.</li>
		<li>완전히 덮일 때까지 더 많은 OCT를 크라이오몰드에 조심스럽게 떨어뜨립니다. 기포가 형성되지 않도록하십시오. 필요한 경우 일반 집게를 사용하여 OCT 내부의 기포를 제거합니다.</li>
		<li>OCT 코팅 샘플이 있는 cryomold를 드라이아이스 용기에 빠르게 넣습니다. 참고: 조직은 -80°C에서 3년 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 냉동 조직 절개
<ol><li>저온 유지 장치 온도(챔버: -21°C, 표본: -18°C)를 조정하고 새 멸균 블레이드를 삽입합니다.</li>
	<li>온도를 평형으로 만들기 전에 샘플을 저온 유지 장치에 30분 동안 넣습니다.</li>
	<li>샘플 접착을 허용하기 위해 표본 디스크에 OCT의 단일 층을 만듭니다. OCT가 얼도록 하고 조직 샘플을 원하는 방향으로 장착합니다. 알림: 절단면은 블레이드와 평행해야 합니다. 좋은 접착력을 유지하려면 열 추출기를 샘플 상단에 놓습니다. 이전 단계는 드라이 아이스가 담긴 드라이 아이스 용기에서도 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플을 표본 헤드에 놓고 조직 표면(30μm 조직 샘플 섹션 몇 개)을 다듬습니다.</li>
	<li>절편을 위해 관심 영역에 접근할 수 있게 되면 12μm 두께의 절편을 절단하여 실온(RT)에 보관된 라벨이 붙은 현미경 슬라이드에 놓습니다. 알림: 섹션을 수집하려면 슬라이드를 조직 섹션 쪽으로 천천히 움직입니다. 각 슬라이드는 두 개의 간 섹션을 수집 할 수 있습니다.</li>
	<li>슬라이드를 RT에서 10분 동안 건조시킵니다. 알림: 슬라이드는 -20°C에서 6-12개월 동안 또는 -80°C에서 최대 3년 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>4. BODIPY 염색
<ol><li>슬라이드를 RT에서 슬라이드 염색 시스템에서 30분 동안 해동합니다.</li>
	<li>1x PBS로 세척합니다(각각 3분씩 5회).</li>
	<li>배리어 펜을 사용하여 소수성 층으로 섹션을 동그라미로 만듭니다.</li>
	<li>500μg/mL BODIPY 493/503 원액 준비: 1mg의 BODIPY 493/503을 2mL의 용매(90% DMSO, 10% 1x PBS)에 녹입니다. 빛으로부터 보호하십시오. 37 °C에서 1 시간 (9.5-10 W) 동안 초음파 처리. 알림: 용액은 최소 20일 동안 -30°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>1x PBS 997.9μL에 BODIPY 493/503 원액 2μL와 DAPI 원액(5mg/mL) 0.1μL를 첨가하여 BODIPY 염색 용액(1μg/mL)을 준비합니다.</li>
	<li>RT에서 40분 동안 BODIPY 493/503(1μg/mL) 및 DAPI(0.1μg/mL)와 함께 슬라이드(75μL/슬라이드)를 배양합니다. 알림: 이 단계부터 슬라이드를 어두운 곳에 두십시오.</li>
	<li>슬라이드를 1x PBS(각각 5분 동안 3회)로 세척합니다.</li>
	<li>형광 장착 매체를 사용하여 커버슬립으로 슬라이드를 장착하고 30분 동안 건조시킨 다음 매니큐어로 밀봉합니다. 알림: 슬라이드는 이미징될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 지질 정량
<ol><li>혈청 총 콜레스테롤 및 TG 수치를 자동으로 검증된 방법과 장비를 사용하여 측정합니다.</li>
	<li>제조사의 프로토콜에 따라 트리글리세라이드 비색 분석 키트(Table of Materials)를 사용하여 간 TG 수준을 측정합니다.</li>
</ol>6. 이미지 획득
<ol><li>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>이미지 시각화 및 획득을 위해 20x 대물렌즈(plan-apochromat: 20x/0.8)가 있는 컨포칼 현미경을 사용합니다.</li>
	<li>BODIPY 493/503과 DAPI 간의 혼선을 방지하려면 컨포칼 소프트웨어에서 순차(최상의 신호) 스캔 모드를 사용하십시오.</li>
	<li>488 nm 아르곤 레이저 라인을 사용하여 BODIPY 593/503을 자극하고 405 nm 레이저 라인을 사용하여 DAPI를 자극합니다. BODIPY 493/589의 경우 방출 범위를 493-503nm로, DAPI의 경우 410-464nm로 설정합니다.</li>
	<li>핀홀: 1 AU, 해상도: 1,024 픽셀 x 1,024 픽셀, 비트 심도: 12, 픽셀 크기: 0.415 μm, 양방향 모드, 스캔 속도: 7 (20x 대물렌즈의 경우 ~1.58 μs/픽셀), 라인 평균: 2x, 디지털 줌: 1. 참고: 위에서 언급한 스캐닝 매개변수는 사용되는 각 컨포칼 현미경 및 대물렌즈에 맞게 최적화되어야 합니다.</li>
	<li>범위 표시기에서 포화 픽셀이 감지되지 않도록 게인과 디지털 게인을 적절하게 설정하십시오. 알림: 오프셋을 조정하여 배경 신호를 수정하십시오.</li>
	<li>LD가 올바르게 식별되면 BODIPY 및 DAPI 채널을 사용하여 이미지를 획득합니다. 참고: 모든 화상은 각 컬러 채널에 대해 동일한 조건(노출 및 일반 설정)으로 촬영해야 합니다.</li>
	<li>광역 이미지를 생성하려면(그림 2) 대물렌즈를 a10x 대물렌즈(평면-네오플루어: 10x/0.3)로 변경합니다.</li>
	<li>타일 스캔 모드를 선택하고 이미지 5개당 5개의 모자이크를 만듭니다. 참고: 이 작업에서는 분석을 위해 타일을 적절하게 병합하기 위해 각 타일이 10% 겹쳤습니다.</li>
	<li>3D 및 직교 뷰(그림 3A)를 만들려면 커버 유리 위에 이멀젼 오일 한 방울을 떨어뜨리고 대물렌즈를 40x 대물렌즈(평면-네오플루어: 40x/1.30 오일)로 변경합니다.</li>
	<li>Z-스택 모드를 선택하고 Z 평면을 조정하여 최적의 두께(~0.5μm)로 광학 슬라이스로 획득할 첫 번째 위치와 마지막 위치를 정의하여 모든 액적이 캡처되도록 합니다. 참고: 이미지 획득 속도를 높이고 표백을 방지하기 위해 광학 슬라이스를 최적이 아닌 크기로 조정하여 30D 재구성을 위해 최소 3% 오버샘플링을 보장할 수 있습니다.</li>
	<li>직교 모듈을 선택하고 직교 뷰를 생성합니다.</li>
	<li>컨포칼 현미경 소프트웨어로 투명 렌더링 모드에 따라 3D 모듈을 선택하여 3D 이미지를 획득합니다.</li>
</ol>7. 이미지 분석
<ol><li>CellProfiler(버전 4.2.5)를 사용하여 단일 평면 이미지(20x 배율)를 처리하고 분석합니다. 참고: 이 작업에 사용된 파이프라인은 Adomshick et al.45.</li>
	<li>CellProfiler 창의 왼쪽 상단 모서리에 있는 이미지 모듈을 클릭하고 이미지를 .tiff 파일로 업로드합니다.</li>
	<li>NamesAndTypes 모듈을 사용하여 파일 이름을 기준으로 BODIPY-(물방울)와 DAPI-(핵) 염색 이미지를 정렬합니다. BODIPY 염색 이미지로만 LD 분석을 수행합니다.</li>
	<li>파이프라인 구성을 시작하려면 모듈 조정(Adjust Modules)을 클릭하고 ColorToGray 모듈을 선택하여 이미지를 회색조 이미지로 변환합니다. 참고: 물체를 식별하려면 그레이스케일 이미지가 필요합니다.</li>
	<li>회색조 이미지를 사용하는 IdentifyPrimaryObjects 모듈을 사용하여 물방울을 식별합니다. 알림: 이 모듈의 매개변수는 올바른 LD 식별을 위해 조정되어야 합니다. 이 작업에서는 6픽셀에서 300픽셀 사이의 크기와 임계값 보정 계수가 1.0인 LD를 정의하여 가장 정확한 식별을 도출했습니다.</li>
	<li>식별된 지질 방울의 픽셀 강도를 측정하려면 MeasureObjectIntensity 모듈을 추가합니다.</li>
	<li>FilterObjects 모듈을 추가하여 가장 강한 신호만 정량화하고 덜 강한 신호는 최종 지질 액적 분석에서 제외하도록 합니다(최소 강도: 0.15, 최대 강도: 1 임의 단위).</li>
	<li>출력 데이터와 관련된 LD를 측정하려면 MeasureObjectSizeShape 모듈을 추가합니다.</li>
	<li>이 시점에서 OverlayOutlines 모듈을 추가하여 식별된 물방울을 원본 이미지에 오버레이하여 처리되지 않은 이미지에서도 분할이 정확하게 보이도록 합니다. 알림: 이것은 선택적(품질 관리) 단계입니다.</li>
	<li>마지막에 ExportToSpreadsheet 모듈을 추가하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 이미지 분석 버튼을 클릭합니다.</li>
</ol>8. 통계 분석
<ol><li>통계 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 결과를 평균± 표준 오차(S.E.M.)로 표현합니다. 참고: 이 연구에서는 GraphPad 소프트웨어를 통계 분석에 사용했습니다.</li>
	<li>Kolmogorov-Smirnov 검정을 사용하여 값의 분포를 분석하여 정규성에서 유의한 편차를 평가합니다. 스튜던트의 unpaired t-검정을 사용하여 모수 데이터를 분석합니다. 참고: p < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.</li>
</ol>

3D Fluorescence Lipid Droplet Reconstruction을 통한 간 지방증 평가

저자는 공개 할 것이 없습니다.

LD 평가를 위한 이 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜은 간 지방증 평가를 위한 새로운 이미징 접근 방식을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 비만과 지방간 질환 사이의 강한 상관관계를 감안할 때, 간지방증의 동물 모델을 확립하기 위해 서양식 고지방 식단이 사용되었다26. 간 TG 함량의 강력한 증가는 정량적 트리글리세리드 비색 분석 키트에 의해 확인되었으며, 이는 HFD를 먹인 동...

지질 방울(LD)은 일반적으로 에너지 저장소로 간주되며, 지질 저장을 매개하는 특수 세포 소기관이며, 인지질 단층 1,2,3에 의해 캡슐화된 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세리드(TG)를 주로 포함하는 소수성 중성 지질 코어로 구성됩니다.
LD 생물 발생은 트리 아실 글리세롤 (TAG)과 스테롤 에스테르의 합성으로 시작하여 소포체 (ER)에서 발생합니다. 중성 지질은 낮은 농도에서 ER 이중층의 소엽 사이에서 확산되지만 세포 내 농도가 증가하면 ER 막에서 거의 구형의 물방울로 자라서 싹이 트는 오일 렌즈로 합쳐집니다4. 그 후, ER 이중층 및 세포질의 단백질, 특히 페리핀(PLIN) 단백질 패밀리는 LD의 표면으로 전위되어 출아를 촉진합니다 5,6,7,8,9.
새로운 지방산 합성과 LD 융합 또는 합체를 통해 LD는 다양한 크기로 성장합니다. 따라서 LD의 크기와 수는 세포 유형에 따라 상당히 다릅니다. 초기 LD(iLDs)로 알려진 작은 액적(직경 300-800 nm)은 거의 모든 세포에서 형성될 수 있다4. LD 형성 후반부에 대부분의 세포는 일부 iLD를 더 큰 iLD (eLD >직경 1μm)로 전환 할 수 있습니다. 그러나 지방 세포 및 간세포와 같은 특정 세포 유형만이 거대 또는 초대형 LD(직경이 최대 수십 미크론)를 형성할 수 있는 능력을 가지고 있습니다4,10.
LD는 세포 지질 대사의 조절, 지방 독성 억제, ER 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애 및 궁극적으로 유리 지방산(FA)으로 인한 세포 사멸을 예방하는 데 매우 중요한 역할을 합니다11,12,13,14. 또한, LD는 또한 유전자 발현의 조절, 바이러스 복제 단백질 격리, 막 이동 및 신호 전달에 연루되어 있습니다15,16,17. 따라서 LD 생물 발생의 잘못된 조절은 대사 증후군, 비만, 제2형 진성 당뇨병(T2DM) 및/또는 동맥경화와 관련된 만성 질환의 특징입니다.
간은 대사의 중심지로서 지질을 저장하고 처리함으로써 지질 대사를 주로 담당하기 때문에 지방 독성에 의해 지속적으로 위협을 받고 있다21. 간 지방증(HS)은 일련의 진행성 간 질환의 공통적인 특징이며 궁극적으로 간 대사 기능 장애, 염증 및 진행된 형태의 비알코올성 지방간 질환을 유발할 수 있는 세포질 LD의 형태로 과도한 세포 내 지질 축적을 특징으로 합니다22,23,24,25. HS는 지방산 산화 및 트리글리세리드로 매우 저밀도 지단백질(VLDLs)로 내보내는 속도가 혈장 및 de novo 지방산 합성으로부터 간 지방산 흡수 속도보다 낮을 때 발생한다26. 간 지질 축적은 종종 미세소포성 지방증과 대수포성 지방증의 두 가지 형태로 발생하며, 이들은 뚜렷한 세포구조학적 특성을 나타낸다27. 전형적으로, 미세 소포 지방증은 핵이 중앙에 배치 된 간세포 전체에 분산 된 작은 LD의 존재를 특징으로하는 반면, 대대 소포 지방증은 간세포의 대부분을 차지하는 하나의 큰 LD의 존재를 특징으로하며, 핵을 주변으로 밀어 낸다28,29. 특히, 이 두 가지 유형의 지방증은 종종 함께 발견되며, 증거가 여전히 일치하지 않기 때문에 이 두 가지 LD 패턴이 질병 발병에 어떻게 영향을 미치는지는 불분명합니다31,32,33,34. 그러나 이러한 유형의 분석은 LD의 동적 거동을 이해하고 간 지방증을 특성화하기 위한 전임상 및 임상 연구에서 종종 "참조 표준"으로 사용됩니다 29,34,35,36.
HS 진단 및 등급을 매기기 위한 황금 표준인 간 생검은 조직학적 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 분석에 의해 일상적으로 평가되며, 여기서 지질 방울은 H&E 염색 간 섹션37에서 염색되지 않은 액포로 평가됩니다. 대수포성 지방증 평가에는 허용되지만, 이러한 유형의 염색은 일반적으로 미세소포성 지방증의 평가를 좁힌다38. ORO(Oil Red O)와 같은 지질 용해성 디아조 염료는 명시야 현미경과 결합하여 세포 내 지질 저장을 분석하지만, (i) 염색 과정에서 에탄올 또는 이소프로판올을 사용하면 세포가 고정되어 있음에도 불구하고 종종 천연 LD의 파괴와 간헐적인 융합을 유발합니다39; (ii) ORO 용액은 제한된 저장 수명으로 인해 신선한 분말 용해 및 여과가 필요하기 때문에 시간이 많이 소요되어 덜 일관된 결과에 기여합니다. (iii) ORO가 단순한 지질 방울 이상을 염색하고 종종 간 지방증을 과대 평가한다는 사실38.
결과적으로, 나일 레드(Nile Red)와 같은 세포 투과성 친유성 형광단은 앞서 언급한 한계 중 일부를 극복하기 위해 살아있는 샘플 또는 고정된 샘플에 사용되었습니다. 그러나, 세포 지질 소기관 표지의 비특이적 특성은 LD 평가를 반복적으로 좁힌다40. 더욱이, 나일 레드의 스펙트럼 특성은 환경의 극성에 따라 달라지며, 이는 종종 스펙트럼 이동(41)으로 이어질 수 있다.
상기 친유성 형광 프로브는 1,3,5,7,8-펜타메틸-4-보라-3a,4adiaza-s-indacene (여기 파장: 480 nm; 최대 방출: 515 nm; BODIPY 493/503)은 세포 내 LD에 의한 빠른 흡수를 가능하게 하는 소수성 특성을 나타내며, 지질 액적 코어에 축적된 후 밝은 녹색 형광을 방출합니다12. 나일 레드와 달리 BODIPY 493/503은 환경 극성에 민감하지 않으며 LD 이미징을 위해 높은 밝기를 표시하기 때문에 더 선택적인 것으로 나타났습니다. 중성 LD를 염색하기 위해, 이 염료는 살아있는 세포 또는 고정된 세포에서 사용될 수 있고, 다른 염색 및/또는 표지 방법(42)과 성공적으로 결합될 수 있다. 염료의 또 다른 장점은 용액에 넣는 데 약간의 노력이 필요하고 안정하여 각 실험(42)을 위해 새로 준비할 필요가 없다는 것이다. BODIPY 493/503 프로브가 세포 배양에서 LD의 국소화 및 역학을 시각화하는 데 성공적으로 사용되었지만, 일부 보고서에서는 인간 외측광근(43), 쥐 가자미근(42) 및 마우스 내장(44)을 포함한 조직에서 LD 이미징 도구로서 이 염료를 신뢰할 수 있는 것으로 입증했습니다.
여기에서 우리는 간 지방증 동물 모델에서 간 표본의 LD 수, 면적 및 직경을 평가하기 위한 대체 분석 접근 방식으로 최적화된 BODIPY 493/503 기반 프로토콜을 제안합니다. 이 절차에는 간 샘플 준비, 조직 절개, 염색 조건, 이미지 획득 및 데이터 분석이 포함됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10191455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>Used to design the figures</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic analyzer Hitachi 717</td>
			<td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td>
			<td>8177-30-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)</td>
			<td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>221052145</td>
			<td>Used in the cryostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler version 4.2.5</td>
			<td>https://cellprofiler.org/releases/</td>
			<td>Used to analyse the acquired images</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D-8418</td>
			<td>Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic 
			and flammable. Vapors may cause 
			irritation. Manipulate in a fume 
			hood. Avoid direct contact with skin. 
			Wear rubber gloves, protective eye 
			goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice container (styrofoam cooler)</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A26742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish (H 25 mm, &#248; 
			150 mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Used to weigh the liver after dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel</td>
			<td>DAKO Omnis</td>
			<td>S303023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software, version 9.3.1</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat diet</td>
			<td>Envigo, Barcelona, Spain</td>
			<td>MD.08811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Nimatek&#160; 100 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>791/01/14DFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 75 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope&#160; (QUASAR detection unit; )</td>
			<td>Carl Zeiss, germany</td>
			<td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 15 Sterile carbon steel scalpel 
			Blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td>
			<td>&#160;Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td>
			<td>&#160;Used to handle cryosections</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Minipuls 3)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1004170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, 125 mm (5&#34;), No. 3</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining system StainTray</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>&#160;Mucedola</td>
			<td>4RF21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT mounting media</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides colorimetric assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10010303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>&#160;TK 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors - 3 mm 
			cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fluorescent-stained lipid droplets with 3d reconstruction for hepatic steatosis assessment

지질 액적(LD)은 지질 저장을 매개하고 지방 독성을 억제하고 유리 지방산(FA)으로 인한 기능 장애를 예방하는 데 매우 중요한 역할을 하는 특수 세포 기관입니다. 간은 신체의 지방 대사에 중요한 역할을 하기 때문에 미세소포성 및 대수포성 간 지방증의 형태로 LD의 세포 내 축적에 의해 지속적으로 위협을 받고 있습니다. LD의 조직학적 특성 분석은 일반적으로 ORO(Oil Red O) 염색과 같은 지용성 디아조 염료를 기반으로 하지만 여러 가지 단점이 간 표본에서 이 분석을 사용하는 것을 지속적으로 방해합니다. 보다 최근에, 친유성 형광단 493/503은 중성 지질 액적 코어로의 빠른 흡수 및 축적으로 인해 LD를 시각화하고 위치를 찾는 데 널리 사용되었습니다. 대부분의 응용 분야가 세포 배양에서 잘 설명되어 있지만 조직 샘플에서 LD 이미징 도구로서 친유성 형광단 프로브의 신뢰할 수 있는 사용을 입증하는 증거는 적습니다. 여기에서 우리는 고지방 식이(HFD) 유발 간 지방증의 동물 모델에서 간 표본의 LD를 평가하기 위해 최적화된 BODIPY(boron dipyromethene) 493/503 기반 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜은 간 샘플 준비, 조직 절개, BODIPY 493/503 염색, 이미지 획득 및 데이터 분석을 다룹니다. 우리는 HFD 수유 시 간 LD의 증가된 수, 강도, 면적 비율 및 직경을 보여줍니다. 직교 투영과 3D 재구성을 사용하여 LD 코어에서 중성 지질의 전체 함량을 관찰할 수 있었으며, 이는 거의 구형의 물방울로 나타났습니다. 또한, 형광단 BODIPY 493/503을 사용하여 미세소포(1μm <d ≤ 3μm), 중간 소포(3μm <d ≤ 9μm) 및 거대소포(d > 9μm)를 구별할 수 있어 미세소포 및 대수포성 지방증을 성공적으로 구별할 수 있었습니다. 전반적으로, 이 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜은 간 LD 특성 분석을 위한 신뢰할 수 있고 간단한 도구이며 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.

Lipid droplets (LDs), classically viewed as energy depots, are specialized cellular organelles that mediate lipid storage, and they comprise a hydrophobic neutral lipid core, which mainly contains cholesterol esters and triglycerides (TGs), encapsulated by a phospholipid monolayer1,2,3.
LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER), starting with the synthesis of triacylglycerol (TAG) and sterol esters. Neutral lipids are diffused between the leaflets of the ER bilayer at low concentrations but coalesce into oil lenses that grow and bud into nearly spherical droplets from ER membrane when their intracellular concentration increases4. Subsequently, proteins from the ER bilayer and cytosol, particularly the perilipin (PLIN) protein family, translocate to the surfaces of the LDs to facilitate budding5,6,7,8,9.
Through new fatty acid synthesis and LD fusion or coalescence, LDs grow into different sizes. Accordingly, the size and number of LDs differ considerably across different cell types. Small droplets (300-800 nm diameter), which are known as initial LDs (iLDs), can be formed by nearly all cells4. Later in LD formation, most cells are able to convert some iLDs into larger ones-expanding LDs (eLDs &#62;1 &#181;m in diameter). Yet, just specific cell types, such as adipocytes and hepatocytes, have the capacity to form giant or supersized LDs (up to tens of microns in diameter)4,10.
LDs play a very important role in the regulation of cellular lipid metabolism, suppressing lipotoxicity, and preventing ER stress, mitochondrial dysfunction, and, ultimately, cell death caused by free fatty acids (FAs)11,12,13,14. Furthermore, LDs have also been implicated in the regulation of gene expression, viral replication protein sequestration, and membrane trafficking and signaling15,16,17. Therefore, the misregulation of LD biogenesis is a hallmark of chronic diseases associated with metabolic syndrome, obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and/or arteriosclerosis, to name just a few18,19,20.
The liver, as a metabolic hub, is mostly responsible for lipid metabolism by storing and processing lipids, and, therefore, it is constantly threatened by lipotoxicity21. Hepatic steatosis (HS) is a common feature of a series of progressive liver diseases and is characterized by excessive intracellular lipid accumulation in the form of cytosolic LDs that, ultimately, may lead to liver metabolic dysfunction, inflammation, and advanced forms of nonalcoholic fatty liver disease22,23,24,25. HS occurs when the rate of fatty acid oxidation and export as triglycerides within very low-density lipoproteins (VLDLs) is lower than the rate of hepatic fatty acid uptake from the plasma and de novo fatty acid synthesis26. The hepatic accumulation of lipids often occurs in two forms-microvesicular and macrovesicular steatosis-and these display distinct cytoarchitectonic characteristics27. Typically, microvesicular steatosis is characterized by the presence of small LDs dispersed throughout the hepatocyte with the nucleus placed centrally, whereas macrovesicular steatosis is characterized by the presence of a single large LD that occupies the greater part of the hepatocyte, pushing the nucleus to the periphery28,29. Notably, these two types of steatosis are often found together, and it remains unclear how these two LD patterns influence disease pathogenesis, as evidence is still inconsistent31,32,33,34. Yet, such type of analysis is often employed as a &#34;reference standard&#34; in preclinical and clinical studies to understand the dynamic behavior of LDs and characterize hepatic steatosis29,34,35,36.
Liver biopsies, the gold standard for diagnosing and grading HS, are routinely assessed by histological hematoxylin and eosin (H&#38;E) analysis, where lipid droplets are evaluated as unstained vacuoles in H&#38;E-stained liver sections37. While acceptable for macrovesicular steatosis evaluation, this type of staining generally narrows the assessment of microvesicular steatosis38. Lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO), are classically combined with brightfield microscopy to analyze intracellular lipid stores, but these still have a number of disadvantages: (i) the usage of ethanol or isopropanol in the staining process, which often causes the disruption of the native LDs and occasional fusion despite the cells being fixed39; (ii) the time-consuming nature, as ORO solution requires fresh powder dissolving and filtering due to the limited shelf life, thus contributing to less consistent results; (iii) and the fact that ORO stains more than just lipid droplets and often overestimates hepatic steatosis38.
Consequently, cell-permeable lipophilic fluorophores, such as Nile Red, have been used in either live or fixed samples to overcome some of the aforementioned limitations. However, the non-specific nature of cellular lipid organelle labeling repeatedly narrows LD assessments40. Moreover, the spectral properties of Nile Red vary according to the polarity of the environment, which can often lead to spectral shifts41.
The lipophilic fluorescent probe 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitation wavelength: 480 nm; emission maximum: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibits hydrophobicity characteristics that allow its rapid uptake by intracellular LDs, accumulates in the lipid droplet core, and, subsequently, emits bright green fluorescence12. Unlike Nile Red, BODIPY 493/503 is insensitive to the environment polarity and has been shown to be more selective, as it displays high brightness for LD imaging. In order to stain neutral LDs, this dye can be used in live or fixed cells and successfully coupled with other staining and/or labeling methods42. Another advantage of the dye is that it requires little effort to place into a solution and is stable, thus eliminating the need to freshly prepare it for each experiment42. Even though the BODIPY 493/503 probe has been successfully employed to visualize the localization and dynamics of LDs in cell cultures, some reports have also demonstrated the reliable use of this dye as an LD imaging tool in tissues including the human vastus lateralis muscle43, the rat soleus muscle42, and the mouse intestine44.
Herein, we propose an optimized BODIPY 493/503-based protocol as an alternative analytical approach for the evaluation of the LD number, area, and diameter in liver specimens from an animal model of hepatic steatosis. This procedure covers liver sample preparation, tissue sectioning, staining conditions, image acquisition, and data analysis.

저자 스포트라이트: 간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석  

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

This imaging approach allows the three-dimensional reconstruction of hepatic lipid droplet deposition and overcomes the main disadvantages of classic histological staining that narrowed the successful discrimination between micro and macrovesicular steatosis. The assessment of microvesicular steatosis is when gold-standard histological stainings are used, both and Oil Red, due to disruption and occasional fusion of native lipid droplets. The pro-BODIPY offers an alternative to the routine protocols for microvesicular hepatic steatosis assessment due to its right hydrophobicity for a fast uptake and effective tagging of lipid droplets, being not only insensitive to the environment polarity, but also extremely selective.This imaging approach encloses broader applications in combination with immunochemistry techniques, allowing the simultaneous detection of other subcellular antigens that may advance the study of lipid droplets'biogenesis and dynamics, underpinning micro and macrovesicular hepatic steatosis.

이 기법을 성공적으로 실행하면 LD 형태(3D 재구성에 기반한 모양 및 지질 코어 밀도)의 동시 특성화와 공간 분포, 총 면적당 수 및 평균 크기(위에서 설명한 파이프라인으로 평가, 그림 1)를 위한 투명한 지질 액적 염색이 가능해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65206/65206fig01.jpg"> 그?...

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여기에서 우리는 간 조직의 지질 액적 특성 분석을 위해 최적화된 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜을 입증합니다. 직교 투영 및 3D 재구성의 사용을 통해 형광단은 미세소포와 대소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 가능하게 하고 간 지방증 평가를 위한 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

이 이미징 접근법은 간 지질 액적 침착의 3차원 재구성을 가능하게 하고 미세 및 거대 소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 좁힌 고전적인 조직학적 염색의 주요 단점을 극복합니다. 미세소포성 지방증의 평가는 천연 지질 방울의 파괴 및 간헐적인 융합으로 인해 금본위제 조직학적 염색과 Oil Red 모두를 사용하는 경우입니다. pro-BODIPY는 지질 방울의 빠른 흡수와 효과적인 태깅을 위한 올바른 소수성으로 인해 미세소포성 간 지방증 평가를 위한 일상적인 프로토콜에 대한 대안을 제공하며, 환경 극성에 둔감할 뿐만 아니라 매우 선택적입니다.이 이미징 접근 방식은 면역 화학 기술과 함께 더 광범위한 응용 분야를 포괄하여 미세 및 대수포성 간 지방증을 뒷받침하는 지질 방울의 생물 발생 및 역학 연구를 발전시킬 수 있는 다른 세포내 항원의 동시 검출을 가능하게 합니다.

analysis-fluorescent-stained-lipid-droplets-with-3d-reconstruction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

3.0K 조회수.  University of Coimbra. 이 이미징 접근법은 간 지질 액적 침착의 3차원 재구성을 가능하게 하고 미세 및 거대 소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 좁힌 고전적인 조직학적 염색의 주요 단점을 극복합니다. 미세소포성 지방증의 평가는 천연 지질 방울의 파괴 및 간헐적인 융합으로 인해 금본위제 조직학적 염색과 Oil Red 모두를 사용하는 경우입니다. pro-BODIPY는 지질 방울의 빠른 흡수와 효과적인 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: 간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석  

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

연구

생화학

Frozen Liver Tissue Sectioning and BODIPY Staining of Lipid Droplets

Turn on the cryostat and cut 12-micron-thick sections of the frozen liver tissue collected from a rat. Place the sections onto the labeled microscope slides at room temperature. For BODIPY staining, wash the tissue sections thrice with PBS for five minutes each.After the last wash, circle the sections on the slide with a hydrophobic layer using a barrier pen. Prepare a staining solution containing BODIPY 493/503 and DAPI. Then, pipette 75 microliters of the solution onto each slide.Incubate the slides at room temperature for 40 minutes in the dark. Following incubation, wash the slides thrice with PBS for five minutes each. Then, using a fluorescence mounting medium, carefully mount cover slips on each slide.Allow the slides to dry for 30 minutes before sealing the edges with nail polish.

냉동 간 조직 절편 및 지질 방울의 BODIPY 염색

Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

Turn on the laser scanning confocal microscope and place the slide on the slide holder. For image visualization and acquisition, select the 20X objective lens. From the confocal software, select sequential scan mode to avoid crosstalk between the BODIPY 493/503 and DAPI.Then excite the BODIPY 493/503 die using the 488 nanometer argon laser line and the DAPI stain using the 405 nanometer laser line. Set the emission ranges at 493 to 589 nanometers for BODIPY and 410 to 464 nanometers for DAPI. Next, configure the microscope settings by adjusting frame sizes, scan speed, and averaging which includes number two times bit depth as 12 bits, direction as bidirectional, scan area digital zoom minus one, and pinhole minus one area unit.Adjust the gain and digital gain settings. Ensure there are no saturated pixels as indicated by the range indicator. After accurately identifying the lipid droplets, acquire the image with the BODIPY and DAPI channels.To create wide area images, switch to a 10X subjective lens. Then activate tile scan mode and configure it to generate five by five mosaic images. To generate 3D and orthogonal views, apply a drop of immersion oil on the top of the cover glass and change the objective lens to a 40X lens.Select the Z-stack mode. Adjust the Z-plane to define the first and last positions for image capture, ensuring an optical slice thickness of approximately 0.5 microns to capture all droplets in focus. Select the ortho module and create orthogonal views.Acquire 3D images by selecting the 3D module following transparency rendering mode. After image acquisition, begin processing and analyzing single plane images using CellProfiler. Upload the images in TIF format by clicking on the images mode in the top left corner of the CellProfiler interface.Use the names and types module to sort between BODIPY droplet and DAPI nuclei stained images based on the filenames. For lipid droplet analysis, use only BODIPY stained images. Initiate pipeline construction by clicking on adjust modules and select the color to gray module to convert the images into gray scale.Then using identify primary objects module, define lipid droplets between 6 to 300 pixels and a threshold correction factor of one to detect lipid droplets within the gray scale images. To measure the pixel intensity of the identified lipid droplets, add a measure object intensity module. Incorporate an additional filter objects module to ensure that only the strongest signals are quantified while less intense signals are excluded from the final lipid droplet analysis.Next, to measure the lipid droplets related to the output data, add the measure object size shape module. Then add an overlay outlines module to overlay the identified droplet on the original image and thus ensure that the segmentation looks accurate on the unprocessed image as well. Once done, add an export to spreadsheet module and click on the analyze images button from the bottom left corner.Compared to the control, HFD-fed animals presented a pronounced dyslipidemic profile and subtle increase in circulating triglycerides levels. Wide area images revealed increased lipid droplets across the livers of HFD-fed animals. Analysis with CellProfiler revealed an increased number of hepatic lipid droplets, augmented BODIPY fluorescence intensity, 360%area ratio, and larger diameters.Size distribution in HFD-fed animals revealed an increase in macro vesicular hepatic lipid droplets of more than nine microns and a reduction in microvesicles of less than three microns.