이 연구는 절강성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Zhejiang Province) 보조금(Z23H290001, LY19H280001)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (82274364, 81673607 및 81774011); Huzhou 과학 기술 보조금의 공공 복지 연구 프로젝트(2021GY49, 2018GZ24). 절강 중국 의과 대학 중국 의학 아카데미 의학 연구 센터 공공 플랫폼의 큰 도움, 기술 지원 및 실험 지원에 감사드립니다.

1. 재료 준비
<ol><li>12mL의 DMEM 배지(10% 소 태아 혈청 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신)에서 2 x 106 Panc02 세포를 배양하고 48시간 동안 5% 이산화탄소 및 95% 공기의 분위기에서 37°C 및 95% 습도를 유지합니다.</li>
	<li>Panc02 세포를 수집하고 28 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 샘플의 크기가 적절한지 확인하십시오(1 x 107 셀), 그렇지 않으면 다음 고정 및 탈수 단계가 제대로 작동하지 않습니다.</li>
	<li>2.5% 글루타르알데히드 1mL를 고정액으로 첨가하여 신선한 Panc02 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 4°C에서 밤새 고정합니다. 알림: 샘플은 다음 단계(1,006-5단계)에서 1.3분 동안 1.11 x g 로 원심분리해야 합니다.</li>
	<li>고정액을 흡인하고, 시료를 0.1 M 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 헹구고, 실온에서 각각 10분 동안 이중 증류수(ddH2O)로 2회 헹구었다.</li>
	<li>1% 사산화오스뮴(OsO4)과 1.5% 페로시안화 칼륨을 포함하는 용액 50μL를 4°C에서 1:1의 비율로 1시간 동안 추가합니다. 이어서, 매번 10분 동안 0.1 M PBS로 2회 헹구고,ddH2O로 10분 더 헹구었다.</li>
	<li>1 % thiocarbohydrazide (TCH) 1 mL를 첨가하고, 실온에서 30 분 내지 1 시간 동안 배양 한 후, ddH2O로 4 회 10 분 동안 헹구었다.</li>
	<li>50 μL의 1 % OsO 4를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 고정 한 다음, ddH2O로 매번 10 분 동안4 회 헹구었다.</li>
	<li>4°C에서 하룻밤 동안 2% 우라닐 아세테이트 1mL를 첨가한 다음,ddH2O로 4회 10분 동안 헹구었다.</li>
	<li>1°C에서 1mL의 Walton 용액(0.066g의 질산납을 0.03mol/L 아스파라긴산 원액 10mL에 용해)을 추가하여 1시간 동안 추가로 배양합니다.</li>
	<li>ddH2O로 매번 10분 동안 4회 헹구고, 그 후 매번 10분 동안 등급이 매겨진 알코올 시리즈로 탈수한다: 50% 알코올, 70% 알코올, 80% 알코올, 90% 알코올 1x 및 100% 알코올 2x. 그런 다음 매번 100% 아세톤에서 10분 동안 두 번 탈수합니다. 탈수를 위해 각 용액 1mL를 사용하십시오.</li>
	<li>200μL의 아세톤을 Pon 812 에폭시 수지와 3:1, 1:1 및 1:3의 비율로 혼합합니다. 샘플을 실온에서 각각 2시간, 4시간 및 4시간 동안 수지에 담근 다음 100% Pon 812 에폭시 수지를 취하여 밤새 함침시킵니다. 알림: 염색 및 수지 포매 단계를 수행할 때 흄 후드는 독성 물질이므로 작동하는 것이 중요합니다. 또한 실험 중에는 실험복과 내용제성 장갑을 착용해야 합니다.</li>
	<li>시편을 매립 몰드에 넣은 다음 60°C의 오븐에 48시간 동안 넣어 중합합니다. 플랫 임베딩29 를 사용하여 샘플 주변의 수지 모양을 줄입니다. 이는 시편 설치를 단순화하고 후속 이미지 분할에 대한 대전 아티팩트의 영향을 줄입니다. 참고: 연속적으로 수평 절단면을 생성하기 위해 금형 구멍에 소량의 수지를 추가할 수 있으며 과도하게 채우지 않도록 주의해야 합니다.</li>
	<li>먼저 실리콘 웨이퍼를 세척한 다음 농축된 H2SO4/H 2 O2용액으로 30분 동안 친수성화하여 실리콘 웨이퍼를 준비합니다. 친수화된 실리콘 웨이퍼 상에 70 nm 두께의 스트립을 울트라마이크로톰을 이용하여 연속적으로 슬라이스하고, 이를 60°C 오븐에서 10분 동안 건조시켰다. 알림: 슬라이스 손실이나 변형을 방지하기 위해 슬라이스가 웨이퍼 표면에 떠 있을 때 슬라이스를 천천히 캡처합니다.</li>
</ol>2. 이미지 획득 및 3차원 재구성
<ol><li>스테이지에 실리콘 웨이퍼를 장착하기 전에 섹션을 증류수로 세 번 세척하고 자연 건조합니다. 전도성 탄소 테이프를 1cm x 0.5cm 크기로 자르고 실리콘 웨이퍼와 SEM 시편 스테이지 사이에 붙여서 샘플 설정을 완료합니다(그림 2E).</li>
	<li>FE-SEM 가속 전압 파라미터를 2mm의 작동 거리에서 4kV로 설정합니다(그림 3B 및 표 1). 알림: 신호 대 잡음비를 개선하고 이미지의 노이즈를 줄이려면 가능하면 낮은 배율로 관찰하십시오. 배수가 증가함에 따라 SEM의 스캐닝 범위가 감소하여 이미지에 대한 전하 축적이 증가합니다.</li>
	<li>상단 메뉴 표시줄에서 H/L 아이콘을 클릭합니다. 먼저 저배율에서 대상 슬라이스 스트립의 첫 번째 섹션의 방향을 지정한 다음 H/L 옵션(그림 3A)을 다시 클릭하여 고배율 모드로 전환합니다. 이미지 밝기, 대비 및 배율을 조정하여 관심 있는 구조에 적합한 이미지를 수집합니다.</li>
	<li>프로젝트 보기(Project View) > 오픈 데이터(Open Data)를 선택하고 분석할 이미지 파일을 소프트웨어로 가져옵니다.</li>
	<li>슬라이스 정렬(Align Slices) > 편집(Edit)(그림 4B)을 클릭하여 사진을 정렬하고 이미지 투명도를 수정하여 왼쪽 하단 메뉴 모음에서 강도 범위(Intensity Range) 값을 조정합니다. 여기서는 반자동 정렬 전략을 사용합니다. 특히 자동 정렬을 통해 사진이 이전 그림과 겹치도록 한 다음 수동 미세 조정을 수행합니다. 참고: 이 작업에서는 정렬 과정에서 이전 이미지를 참조로 사용하고 이동 및 회전 작업을 활용하여 두 이미지의 대상 구조를 최대한 겹쳤습니다. 현재 슬라이스 쌍 정렬을 클릭하면 이미지를 자동으로 정렬하는 데 도움이 될 수 있지만 잘못된 배치가 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>하위 볼륨 추출 모듈을 선택하고 정렬된 데이터 세트를 전체 스택의 겹치는 부분의 크기에 맞게 자릅니다.</li>
	<li>Segmentation 하위 섹션(그림 4C)에서 Resample > Segmentation(세그멘테이션) > Save(저장)를 선택합니다. 마술 지팡이의 임계 값과 브러시 도구의 크기를 선택하여 올바른 범위를 선택하십시오. 여기서도 먼저 마술 지팡이를 사용하여 적절한 넓은 영역을 자동으로 선택한 다음 브러시를 사용하여 세부 사항을 정확하게 설명하는 반자동 분할 방법을 채택합니다. 참고 : Magic Wand 는 마스킹 값을 변경하고 Draw Limit Line을 사용하여 관심 구조와 주변 구조 사이에 존재하는 픽셀 강도의 명백한 차이를 기반으로 세그먼트 이미지에 적용 할 수 있습니다. 이미지 획득 중에 생성된 충전 아티팩트를 구별할 수 없습니다. 따라서 대상 지역에 대한 잘못된 조각화가 발생할 수 있습니다. 브러시 도구를 사용하여 생물학적 구조를 정확하게 재구성하기 위해 수동으로 분할할 수 있습니다.</li>
	<li>Segmentation > Selection(선택)에서 + 아이콘을 클릭하여 선택한 영역을 추가합니다(그림 4C).</li>
	<li>위의 단계(2.8)를 반복하여 관심 있는 미세 구조를 재구성하기 위한 선택이 완료될 때까지 다른 이미지에서 동일한 대상 구조를 선택합니다. 참고: 미토콘드리아 리모델링 과정 동안 대상 물체의 선택은 순차적 이미지 그룹의 중간에 있는 그림에서 수행되어야 합니다. 첫 번째 또는 마지막 그림에서 필요한 영역을 선택하면 재구성 결과가 완전한 3D 시각화를 제공 할 수 없습니다.</li>
	<li>지역 분할을 완료한 후 개체 크기 및 사진 해상도에 대한 최상의 결과에 따라 이미지 파일을 생성합니다. 자르기 편집기(Crop Editor)를 클릭한 다음 가상 슬라이더(Virtual Slider ) 상자에 숫자 6을 입력합니다(그림 4C).</li>
	<li>왼쪽의 드롭다운 메뉴에서 프로젝트(Project ) 하위 섹션 아래의 회색 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 서피스 생성(Generate Surface) > 생성(Create) > 적용(Apply)을 선택합니다. 생성된 파일에서 지표면 뷰 모듈을 사용하여 지표면 구조와 3D 표현을 작성합니다.</li>
</ol>3. 정량화
<ol><li>Remove Small Spots(작은 반점 제거)> Apply(적용)를 클릭합니다(그림 4D). 프로젝트 하위 섹션에서 회색 영역을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 레이블 분석 > 적용을 선택합니다(그림 4D).</li>
	<li>열의 이름을 사용자 지정하고 측정값 그룹을 선택합니다. 기본 측정(Native Measurements) 상자에서 볼륨3d(Volume3d) 및 길이3d(Length3d)를 선택합니다. </li>
	<li>화면 왼쪽 하단 모서리에 있는 적용 버튼을 클릭합니다. 데이터를 복사하고 GraphPad와 같은 통계 소프트웨어에서 그래프를 작성합니다.</li>
</ol>

췌장암 세포에서 미토콘드리아 크리스타를 시각화하는 3D 기술

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 방법은 직렬 초박형 섹션에서 생성된 2D 단층 촬영 이미지의 적층 및 분할에 전자 현미경 및 이미지 처리 기술을 적용하는 것과 관련된 3D 재구성 기술을 적용하기 위한 유용한 단계별 가이드입니다. 이 프로토콜은 세포 소기관 미세 구조의 3D 시각화로 해결할 수 있는 2D 이미지의 한계를 강조하며, 이는 고해상도 수준에서 구조의 강력한 재현성과 더 높은 정확도의 장점이 있습니다....

미토콘드리아는 세포에서 가장 중요한 세포 기관 중 하나입니다. 이들은 세포 생물 에너지와 신진대사의 중심 허브 역할을 하며1,2 암에 중요한 역할을 한다3. 췌장암(Pancreatic cancer, PC)은 급격한 확산과 높은 사망률로 인해 치료하기 가장 어려운 암 중 하나이다.4 미토콘드리아 기능 장애는 주로 미토콘드리아 형태 3,5,6,7의 변화에 의해 발생하며, PC 8의 기저에 있는 질병 기전과 관련이 있다. 미토콘드리아는 또한 매우 동적이며, 이는 네트워크 연결성과 크리스타 구조의 빈번하고 역동적인 변화에 의해 반영된다9. 크리스타 구조의 재형성은 미토콘드리아 기능 및 세포 상태에 직접적인 영향을 미칠 수 있다 10,11, 이는 종양 세포 성장, 전이 및 종양 미세환경 변화12,13 동안 현저하게 변화된다.
최근 몇 년 동안 과학자들은 EM 관찰14,15,16,17을 사용하여 이 세포 기관을 연구했습니다. 예를 들어, 연구자들은 3D 재구성 기술 6,7,18,19를 사용하여 미토콘드리아 역학을 분석했습니다. 전자 현미경 이미지의 3D 재구성에 대한 일반적인 개념과 방법은 일찍이 1968년에 공식적으로 확립되었습니다20 전자 현미경, 전자 회절 및 컴퓨터 이미지 처리를 결합하여 T4 파지 테일을 재구성하는 것을 포함했습니다. 지금까지 전자 현미경 3D 이미징 기술은 이미지 해상도 (21), 자동화 정도 (22) 및 처리 볼륨 (23) 측면에서 상당한 발전을 이루었으며 조직 수준에서 나노 미터 규모(24)의 세포 소기관 미세 구조 수준에 이르기까지 생물학 연구에서 점점 더 광범위한 규모로 사용되어 왔습니다. 최근 몇 년 동안, 전자 현미경 3D 이미징은 광범위한 응용 분야에서 유망한 기술이되었습니다25,26,27.
미토콘드리아 크리스타에 대한 관심 증가는 특히 초구조적 체적 이미징에 대한 필수 요구 사항을 보여줍니다. 투과 전자 현미경 (TEM)은 구리 그리드 (400 메쉬) (28)에서 수집 된 샘플을 시각화하는 데 사용되었으며, 전자빔은 섹션을 통과합니다. 그러나, 구리 그리드의 제한된 범위로 인해, 동일한 샘플(29)의 연속적인 슬라이스를 완전히 이미지화하는 것은 불가능하다. 이것은 TEM 이미징 중 표적 구조 연구를 복잡하게 만듭니다. 추가적으로, TEM은 다수의 슬라이스를 절단 및 수집하고 이들을 순차적으로 이미징하는 것을 포함하여, 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉬운 수동 작업에 의존하므로(21), 대량의 샘플(23)의 초구조적 재구성에는 적합하지 않다. 현재 TEM 카메라 어레이(TEMCA)30 또는 2개의 2세대 TEMCA 시스템(TEMCA2)31과 같은 특수 장비를 사용하여 대용량 샘플 이미징의 고해상도 재구성을 달성하여 짧은 시간에 자동화된 고처리량 이미징을 가능하게 합니다. 그러나 이러한 유형의 이미징은 맞춤형 장비에 대한 요구 사항으로 인해 구하기 쉽고 보편적이라는 장점이 없습니다.
TEM과 비교하여, SEM(32,33)에 기초하여 넓은 영역에 대한 수천 개의 직렬 체적 이미지를 자동으로 생성하는 방법은 직렬 이미징의 효율성 및 신뢰성을 향상시키고, 더 높은 z-해상도(34)를 제공한다. 예를 들어, 직렬 블록면 주사 전자 현미경 (SBF-SEM)과 집속 이온 빔 주사 전자 현미경 (FIB-SEM)은 모두 고속, 효율성 및 해상도 35,36으로 미세 구조의3D 재구성을 가능하게했습니다. 그러나 SBF-SEM의 다이아몬드 나이프 또는 FIB-SEM33,37의 집속 이온 빔으로 밀링하여 블록 표면을 기계적으로 깎는 것은 불가피합니다. 샘플에 대한 두 가지 방법의 파괴성으로 인해 추가 분석을 위해 동일한 표적 구조를 다시 재구성 할 수 없습니다38,39,40. 또한, 병리학적 변화를 관찰하기 위해 EM을 사용하여 암세포의 3차원 소기관 미세구조를 재구성하려는 연구는 거의 없었다12. 이러한 이유로 췌장암 세포와 같은 암세포의 병리학적 기전을 더 명확히 하기 위해 울트라마이크로톰과 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM)을 사용하여 연속 단면 이미지를 3D로 재구성하는 새로운 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하면 효율적이고 접근 가능한 방법을 사용하여 고해상도 데이터를 획득할 수 있습니다. 울트라마이크로톰(ultramicrotome)을 사용하여 만든 직렬 초박형 절편은 그리드 케이스에 반영구적으로 저장될 수 있으며, 몇 년 후에도 여러 번 재이미징할 수 있다(41). FE-SEM은 고해상도 이미징, 고배율 및 다용성을 제공하는 능력으로 인해 다양한 연구 분야에서 도구로서 높은 평가를 받고 있습니다42. 세포 소기관의 미세 구조를 3D로 표시하기 위한 시도로, FE-SEM(43,44)에 의해 생성된 후방 산란 전자를 사용하여 유용한 해상도를 갖는 직렬 2D 이미지 스택을 생성하는 기술은 또한 특수 장비(45) 없이 표적 영역 또는 관련 구조의 높은 처리량 및 다중 스케일 이미징을 달성하는 데 사용될 수 있다. 전하 아티팩트의 생성은 획득된 이미지의 품질에 직접적인 영향을 미치므로 체류 시간을 짧게 유지하는 것이 특히 중요합니다.
따라서, 본 연구는 미토콘드리아 크리스타46의 3D 구조를 재구성하기 위해 이 SEM 기술에 사용된 실험 절차에 대해 자세히 설명합니다. 특히, 미토콘드리아 영역의 반자동 분할을 달성하고 Amira 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성을 디지털화하기 위해 개발된 프로세스를 보여주며, 여기에는 기존의 OTO 표본 준비 방법44,47을 사용하여 슬라이스 샘플을 만들고, 울트라마이크로톰 슬라이싱을 사용하여 섹션 수집을 완료하고, FE-SEM으로 순차적 2D 데이터를 획득하는 것도 포함됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

알려지지 않은 정보가 풍부할 뿐만 아니라 3차원(3D) 관점에서 정교한 세포 소기관 미세 구조의 동적 특징을 이해하는 것은 기계론적 연구에 매우 중요합니다. 전자 현미경(EM)은 우수한 이미징 깊이를 제공하고 고해상도 이미지 스택을 재구성하여 나노미터 규모에서도 세포 소기관의 미세 구조적 형태를 조사할 수 있습니다. 따라서 3D 재구성은 비교할 수 없는 장점으로 인해 중요성이 커지고 있습니다. 주사전자현미경(SEM)은 연속적인 슬라이스에서 동일한 관심 영역에서 큰 구조를 3D로 재구성할 수 있는 고처리량 이미지 획득 기술을 제공합니다. 따라서 세포 소기관의 진정한 3D 미세 구조를 복원하기 위해 대규모 3D 재구성에 SEM을 적용하는 것이 점점 보편화되고 있습니다. 이 프로토콜에서는 췌장암 세포에서 미토콘드리아 크리스타를 연구하기 위해 직렬 초박형 절편과 3D 재구성 기술의 조합을 제안합니다. 이러한 기술이 수행되는 방법에 대한 세부 사항은 오스뮴-티오카르보하이드라지드-오스뮴(OTO) 방법, 직렬 초박형 단면 이미징 및 시각화 디스플레이를 포함하여 단계별로 이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세포 배양 중(그림 1A), 먼저 췌장암 세포를 완전 배양 배지로 배양한 대조군, (1S,3R)-RSL348(RSL3, 페롭토시스 활성제, 100nM) 그룹 및 RSL3(100nM)와 페로스타틴-149(Fer-1, 페롭토시스 억제제, 100nM) 그룹으로 나누었습니다. 상기의 실험 단계를 통해, 주사전자현미경은 대조군, RSL3군, 억제제군(RSL3+Fer-1기)에 대한 38(보충도 1), 43(보충?...

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저자 스포트라이트: 췌장암 세포의 미토콘드리아 초구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법  

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

이 프로젝트는 세포 나노 규모 수준에서 구조를 변화시키고 세포 소기관 형태와 암 병리학 메커니즘 간의 연관성을 확립하여 약물의 항암 효과를 검토하는 것을 목표로 합니다. 이 기술은 특별한 장비 없이 전통적인 전자 현미경 기술과 3차원 재구성 기술을 결합합니다. 다른 기술과 비교하여 이미징 효율과 재구성 유연성, 그리고 언제든지 표적 구조의 실제 재건을 향상시킬 수 있습니다.따라서 매우 쉽고 보편적입니다. 연속적인 초박형 슬라이드의 3차원 재구성 기술은 특정 고가의 장비 없이 실제 입체화학을 반복적으로 복원할 수 있습니다. 언제든지 모든 세포 소기관의 정성 및 정량 분석에 사용할 수 있습니다.그것은 관찰의 쉬운 조작을 실현합니다.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

1.2K 조회수.  School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University. 이 프로젝트는 세포 나노 규모 수준에서 구조를 변화시키고 세포 소기관 형태와 암 병리학 메커니즘 간의 연관성을 확립하여 약물의 항암 효과를 검토하는 것을 목표로 합니다. 이 기술은 특별한 장비 없이 전통적인 전자 현미경 기술과 3차원 재구성 기술을 결합합니다. 다른 기술과 비교하여 이미징 효율과 재구성 유연성, 그리고 언제든지 표적 구조의 실제 재건을 향상시?...

비디오: 저자 스포트라이트: 췌장암 세포의 미토콘드리아 초구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법  

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

연구

암 연구학

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using supernatants from Lactobacillus fermentum cell culture, considered as probiotics cultures. The use of 3D cultures to test Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS) are a better option than testing in 2D monolayers, especially as L. fermentum can produce anti-cancer effects within the gut. L. fermentum supernatant was identified to possess increased anti-proliferative effects against several colorectal cancer (CRC) cells in 3D culture conditions. Interestingly, these effects were strongly related to the culture model, demonstrating the notable ability of L. fermentum to induce cancer cell death. Stable spheroids were generated from diverse CRCs (colorectal cancer cells) using the protocol presented below. This protocol of generating 3D spheroid is time saving and cost effective. This system was developed to easily investigate the anti-cancer effects of LCFS in multiple types of CRC spheroids. As expected, CRC spheroids treated with LCFS strongly induced cell death during the experiment and expressed specific apoptosis molecular markers as analyzed by qRT-PCR, western blotting, and FACS analysis. Therefore, this method is valuable for exploring cell viability and evaluating the efficacy of anti-cancer drugs.

Here methods are presented to understand anti-cancer effects of Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS). Colorectal cancer cell lines show cell deaths when treated with LCFS in 3D cultures. The process of generating spheroids can be optimized depending on the scaffold and the analysis methods presented are useful for evaluating the involved signaling pathways.

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

콜라겐 기반 스캐폴드를 사용한 신경모세포종의 3차원 체외 생체모방 모델

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Robotic Pancreatoduodenectomy for Pancreatic Head Cancer: a Case Report of a Standardized Technique

Robotic pancreatoduodenectomy (RPD) for pancreatic cancer is a challenging procedure. Aberrant vasculature may increase the technical difficulty. Several studies have described the safety of RPD in case of a replaced or aberrant right hepatic artery, but detailed video descriptions of the approach are lacking. This case report describes a step-&#173;by-&#173;step technical video in case of a replaced right hepatic artery. A 58-year-old woman presented with an incidental finding of a 1.7 cm pancreatic head mass. RPD was performed using the da Vinci Xi system and involves a robotic-assisted pancreatico- and hepatico-jejunostomy and open gastro-jejunostomy at the specimen extraction site. The operation time was 410 min with 220 mL of blood loss. The patient had an uncomplicated postoperative course and was discharged after 5 days. Pathology revealed a pancreatic head cancer. RPD is a feasible and safe procedure in case of a replaced hepatic artery when performed in selected patients in high-volume centers by experienced surgeons.

Robotic pancreatoduodenctomy (RPD) has been highly standardized in recent years and may be used in selected patients with pancreatic head cancer, including those with a replaced right hepatic artery. This case report describes a standardized and reproducible technique for RPD, which includes the approach of the Dutch LAELAPS-3 training program to an aberrant vasculature.

췌장두부암에 대한 로봇 췌장 십이지장 절제술 : 표준화 된 기술의 사례 보고서

Robotic pancreatoduodenectomy (RPD) for pancreatic cancer is a challenging procedure. Aberrant vasculature may increase the technical difficulty. Several ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been provided by studies using these models. Cell lines have provided an understanding of the deregulation of molecular signaling associated with breast tumorigenesis, while rodent models are widely used to study cellular and molecular characteristics of breast cancer in vivo. The establishment of 3D cultures of breast epithelial and cancerous cells aids in bridging the gap between in vivo and in vitro models by mimicking the in vivo conditions in vitro. This model can be used to understand the deregulation of complex molecular signaling events and the cellular characteristics during breast carcinogenesis. Here, a 3D culture system is modified to study a phospholipid mediator-induced (Platelet Activating Factor, PAF) transformation. Immunomodulators and other secreted molecules play a major role in tumor initiation and progression in the breast. In the present study, 3D acinar cultures of breast epithelial cells are exposed to PAF exhibited transformation characteristics such as loss of polarity and altered cellular characteristics. This 3D culture system will assist in shedding light on genetic and/or epigenetic perturbations induced by various small molecule entities in the tumor microenvironment. Additionally, this system will also provide a platform for the identification of novel as well as known genes that may be involved in the process of transformation.

The present protocol describes the setting up of 3D 'on top' cultures of a non-transformed breast epithelial cell line, MCF10A, that has been modified to study Platelet Activating Factor (PAF) induced transformation. Immuno-fluorescence has been used to assess the transformation and is discussed in detail.

인지질 매개체는 3차원 배양에서 형질전환을 유도했습니다.

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Surgical Technique for Superior Cervical Ganglionectomy in a Murine Model

Growing evidence suggests that the sympathetic nervous system plays an important role in cancer progression. Adrenergic innervation regulates salivary gland secretion, circadian rhythm, macular degeneration, immune function, and cardiac physiology. Murine surgical sympathectomy is a method for studying the effects of adrenergic innervation by allowing for complete, unilateral adrenergic ablation while avoiding the need for repeated pharmacologic intervention and the associated side effects. However, surgical sympathectomy in mice is technically challenging because of the small size of the superior cervical ganglion. This study describes a surgical technique for reliably identifying and resecting the superior cervical ganglion to ablate the sympathetic nervous system. The successful identification and removal of the ganglion are validated by imaging the fluorescent sympathetic ganglia using a transgenic mouse, identifying post-resection Horner's syndrome, staining for adrenergic markers in the resected ganglia, and observing diminished adrenergic immunofluorescence in the target organs following sympathectomy. This model enables future studies of cancer progression as well as other physiological processes regulated by the sympathetic nervous system.

The present protocol describes a mouse model of the ablation of adrenergic innervation by identifying and resecting the superior cervical ganglion.

쥐 모델에서 우수한 자궁경부 신경절 절제술을 위한 수술 기법

Growing evidence suggests that the sympathetic nervous system plays an important role in cancer progression. Adrenergic innervation regulates salivary ...