이 방법은 뼈 종양 연구를 위한 기능적인 비계를 준비하기 위한 능률적인 전략을 제공합니다. 뼈 외수성 매트릭스를 탈세포화, 골육종 세포의 생존과 활동에 대한 가변 혈청 호환성을 보였다. 이 기술의 주요 장점은 뼈 유래 매트릭스에서 골육종 세포 배양임상 골육종 조직 병리학과 유사한 매우 이종성 형태를 보여준다는 것입니다.
이 방법은 골육종, 유잉 육종 및 뼈에 대한 다른 악성 종양 전이와 같은 뼈 종양의 발달, 약물 민감성의 진행을 조사하기위한 이상적인 모델을 제공합니다. 시작하려면 멸균 수술 가위를 사용하여 마우스를 안락사한 후 4- 6 주 된 BALB / c 마우스를 얻고 뒷사지에서 신선한 비골, 경골 및 대퇴골을 잘라냅니다. 핀셋의 도움으로 상피 조직을 벗겨 낸 다음 가능한 한 많은 연조직을 제거하십시오.
멸균 10m PBS 용액으로 다리 뼈를 헹구어 6센티미터 접시에 혈액을 제거합니다. 뼈를 75%에탄올로 3분간 담그고 PBS로 두 번 헹구습니다. 멸균 된 PBS 튜브와 멸균 50 밀리 리터 원심 분리 튜브에 깨끗한 뼈를 저장 하 고 80 섭씨.
실온에서 얼어 붙은 뼈를 해동한 다음 1 시간 동안 섭씨 80도에서 다시 얼어 붙습니다. 세포 용해 및 조직 고장에 대 한 두 개 이상의 동결 해동 사이클에 뼈를 피사체. 그런 다음 0.5 개의 일반 HCl로 채워진 멸균 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 뼈를 놓고 뼈의 완전하고 균일한 커버리지를 보장하기 위해 부드러운 흔들림으로 궤도 셰이커의 실온에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
탈축 후, 염산 용액을 완전히 분해하고 흐르는 물 에서 뼈를 1 시간 동안 헹구는다. 그런 다음 증류수를 사용하여 궤도 셰이커에서 세척당 15분 동안 뼈를 두 번 씻습니다. 솔루션을 완전히 decant.
탈염된 뼈에서 지질을 추출하려면 메탄올과 클로로폼의 1:1 혼합물로 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 뼈를 놓습니다. 클로로폼 분해를 방지하기 위해 빛을 피하기 위해 주석 호일로 튜브를 감쌉합니다. 그리고 한 시간 동안 궤도 셰이커에 튜브를 넣어.
그런 다음 핀셋을 사용하여 뼈를 주석 호일로 메탄올의 다른 튜브로 30 분 동안 옮길 수 있습니다. 메탄올을 완전히 제거하고 궤도 셰이커에서 15분 동안 증류수를 두 번 씻습니다. 데낸스는 최종 세척수를 세척하고 멸균 상태에서 진행합니다.
멸균 PBS로 6센티미터 접시에 뼈를 헹구고 3분간 헹구습니다. 멸균 0.05%TE 용액 40밀리리터를 50밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 37°C의 이산화탄소 인큐베이터에서 23시간 동안 뼈를 배양합니다. TE 용액을 버리고, 90 g/mL 암피실린과 90 g/mL 카나마이신으로 보충된 멸균 PBS로 두 번 헹구고 궤도 셰이커에서 각각 15분 동안 헹구십시오.
최종 세척을 완전히 제거 한 후 항생제로 멸균 PBS 40 밀리리터로 다시 보충하십시오. 다공성 공간의 효과적인 살균을 달성하기 위해 부드러운 흔들림으로 실온에서 24 시간 동안 철저히 씻으십시오. 그런 다음 뼈를 항생제로 멸균 PBS로 채워진 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다.
준비된 뼈 세포 외 매트릭스는 2 개월 동안 섭씨 4도에서 저장할 수 있습니다. BEM을 75%에탄올에 담그고 30초 동안 손으로 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 PBS로 헹구고 30초, 두 번 헹구습니다.
BEM을 깨끗한 6웰 세포 배양판으로 옮기. 각 웰에 완전한 배양 배지의 2 밀리리터를 추가합니다. 1박 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 동안 BEM을 배양합니다.
표시기 페놀 레드를 포함하는 사전 따뜻워진 PBS의 100 마이크로리터에서 인간 OS 세포주를 가져옵니다. 파이펫을 사용하여 1회 10대 5의 대략적인 농도로 OS 셀을 일시 중단한다. BEM이 근위 또는 탈후 에피피스에서 배지에 완전히 담근 후 바늘을 BEM의 수질 구멍에 관통하고 OS 세포를 BEM에 주입합니다.
OS-BEM 모델을 37°C의 가습된 5%이산화탄소 대기에서 최소 2시간 동안 배양하여 주입된 세포가 BEM에 단단히 부착되도록 합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 접시를 꺼내십시오. 접시에 밀리리터 배양 배지 1개를 넣고 하룻밤 동안 인큐베이터에 보관하여 BEM 배양의 표면을 완전히 코팅합니다.
OS-BEM 모델을 멸균 트위저가 있는 6웰 플레이트의 새로운 웰로 부드럽게 옮기고 1밀리리터 의 신선한 배양 배지를 재공급합니다. 인큐베이터에서 14일 동안 모델을 배양합니다. 14일 잠복식 동안 중간 색상을 모니터링하십시오.
매체가 주황색 또는 노란색으로 변하는 경우, 기존 배지의 절반을 버리고 OS 셀에 대한 건강한 환경을 유지하기 위해 새로운 배지를 추가하여 즉시 배지를 새로 고칩니다. 반전된 형광 현미경하에서 세포 상태를 모니터링하십시오. OS 셀이 플레이트로 확장되면 멸균 핀셋을 사용하여 OS-BEM 모델을 다른 새로운 웰로 부드럽게 전송합니다.
14일 배양 후 PBS로 OS-BEM 모델을 부드럽게 헹구어 배양 매체를 제거합니다. 그런 다음 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 10%의 버퍼링 된 포르말린을 추가하여 조직학적 식별을 수정합니다. 탈염 및 탈세포화 후, BEM은 네이티브 마우스 뼈에 비해 더 강한 탄력성과 끈기로 반투명한 것으로 보입니다.
수질 구멍의 공간에서 약간의 근육 잔류물을 명확하게 관찰 할 수 있습니다. 네이티브 뼈와 탈세포화된 BEM의 밝은 필드 이미징은 세포 핵의 철저한 제거를 보여줍니다. 콜라겐 네트워크 배열의 천연 다공성 구조는 탈세포형 BEM에서 잘 유지됩니다.
또한, 콜라겐 I및 콜라겐 IV를 위한 면역히스토화학 염색은 세포외 매트릭스의 주요 성분이 탈세포화 후 마우스 경골에서 보존된다는 것을 보여준다. 14일 배양 시, 골막과 종말은 모두 OS 세포의 확장에 의해 침투된다. 탈세포화된 BEM의 OS 세포는 OS 섹션의 세포 병리학 적 특징과 유사한 고질적 형태학을 보여줍니다.
14일 동안 BEM 모델에서 배양후 면역히토화학적 분석은 장기 배양에서 큰 이점을 보여준다. 또한, OS 세포 및 BEM 배양, 고발성 골매트릭스 당단백질, 이는 골성 매트릭스에 특이적이다. 이 체외의 3 차원 모델은 표현이 질성과 성공과 골육종 분광의 규제 메커니즘을 입증하는 데 사용되었습니다.
