허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델

이 프로토콜에 사용된 방법 및 이미징 양식은 임상 시험을 진행하기 전에 허혈성 심장에서 유전자 치료의 안전성과 효능에 대한 우수한 이미지를 구성합니다. 이 기술의 주요 장점은 허혈 모델의 낮은 침습성뿐만 아니라 저운동성이지만 여전히 실행 가능한 심장 영역에 대한 유전자 요법의 정확한 표적화입니다. 허혈 수술, 유전자 전달 및 안락사 전에 경흉부 심초음파를 수행하여 검출 가능한 심낭액을 평가하고 심근 변형을 결정하는 것으로 시작합니다.

승모판 수준, 유두 근육 및 정점 수준에서 흉골주위 단축 보기에 접근하기 위해 돼지의 흉골을 가리키는 마커가 있는 돼지 겨드랑이 아래의 세 번째 또는 네 번째 늑간 공간에 변환기를 배치합니다. 그런 다음 acquire를 눌러 클립을 저장합니다. 허혈 수술 직전에 관상동맥 조영술을 수행하기 위해 요오드 조영제와 함께 형광 투시 유도 하에 6-F 카테터를 사용하여 우측 관상동맥, 좌측 상행 관상동맥 및 좌측 전하행 동맥을 영상화합니다.

자가주사기의 시네 이미징의 경우 볼루스 지속 시간을 3초로 설정하고 총 부피를 21밀리리터로 설정한 다음 단일 및 예를 눌러 5F 피그테일 카테터를 통해 요오드 조영제를 좌심실에 투여합니다. 휴식 중인 동물의 시네 이미징을 수행한 다음 도부타민을 정맥 주사하고 스트레스 유도를 위해 용량을 증량합니다. 분당 160회라는 목표 심박수에 도달하면 시네 이미징을 수행하고 피그테일 카테터를 제거합니다.

박출률을 계산하려면 측정 소프트웨어를 열고 해당 이미지의 심실 분석을 선택합니다. 이미지를 스크롤하여 이완기와 수축기의 기간을 선택한 다음 각 기간의 심실 윤곽을 그리는 도구를 선택합니다. 만성 심근 허혈을 유도하기 위해, 유전자 전달 14일 전에 좌측 관상동맥에 코일을 배치하고, 병목성 스텐트를 좌관상동맥으로 미끄러지듯 이동시키고, 스텐트를 제1 대각선까지 말단부로 배치한다.

병목 현상을 제자리에 고정하기 위해 스텐트 대 루멘 비율이 1.3인 인디플레이터를 사용하여 동맥의 공칭 압력으로 스텐트를 팽창시킵니다. 추가로 15초 후 스텐트를 수축시키고 동맥에서 장비를 집어넣은 다음 혈관 조영술을 통해 병목 스텐트를 올바르게 배치합니다. 형광투시 유도하에 혈관조영술 및 기능 측정 후 전기 해부학적 매핑을 위해 대퇴골초를 통해 좌심실에 매핑 카테터를 삽입하고 좌심실에서 최소 100점을 수집하고 수락을 클릭하여 점을 승인합니다.

최종 맵에서는 생존 가능성을 위해 5밀리볼트 이상의 단극 전압을 기준으로 사용합니다. 그리고 저산소증의 경우 가능한 한 낮게, 최소 12%에서 바람직하게는 6% 미만으로 국소 선형 단축을 선택하십시오동물을 안락사시킨 후 흉강에서 심장을 채취합니다. 적출된 심장을 헹구고 대동맥 판막 위에 18게이지 바늘을 놓고 바늘을 관류 펌프에 부착합니다.

750 밀리리터의 1 % 파라 포름 알데히드로 심장을 관류하십시오. 날카로운 칼을 사용하여 심장을 1cm 두께의 조각으로 자르고 유전자 전달 영역에서 샘플을 4% 파라포름알데히드와 액체 질소로 수집합니다. 염색을 위해 샘플을 섭씨 4도에서 48시간 동안 4% 파라포름알데히드에 보관합니다.

유전자 치료의 효능은 15O-water PET 스캔으로 원주 변형률, 박출률 및 심근 관류를 측정하여 분석하였다. 조직 샘플은 심장을 전기 해부학적 지도와 비교하여 유전자 전달 영역에서 직접 수집할 수 있습니다. Beta-galactosidase 염색 후 양성 세포 수를 분석하고, 혈소판/내피세포 부착 분자-1 염색 후 심근 모세혈관 면적을 분석하여 면역조직학적 분석을 통해 이식유전자 발현 및 치료적 혈관신생을 평가하였다.

혈관 조영술을 통해 병목 스텐트를 배치하고 유전자 전달 영역에서 샘플을 채취하는 것이 중요하며, 이는 심장을 전기 해부학적 지도와 비교하여 확인할 수 있습니다. 전반적으로 모든 측정을 가장 재현 가능한 방식으로 수행하는 것이 중요합니다.