이 연구는 샤먼시 과학기술국(3502Z20227197)과 푸젠성 과학기술국(No. 2019J01070, No.2021Y0027)의 지원을 받았습니다.

1. 준비
<ol><li>시료 처리<ol><li>신선한 S. nudus (100g)를 조심스럽게 해부하고 장과 그 내부 액체를 수집하십시오.</li>
		<li>균질화(1,000rpm, 60초)를 위해 300mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)을 추가합니다.</li>
		<li>균질액을 3x 동결-해동합니다.</li>
		<li>시료를 원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하고 상층액을 수집한다. 추가 사용이 있을 때까지 샘플을 4°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 침전<ol><li>상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)과 혼합하고 혼합물을 4°C에서 12시간 동안 방치한다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다.</li>
		<li>원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하여 단백질 침전물을 얻는 단계; 나중에 사용할 수 있도록 4 °C에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 재현탁<ol><li>단백질 침전물을 30mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)으로 재현탁합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 조단백질 용액을 4°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 친화성 크로마토그래피
<ol><li>용액 여과<ol><li>조단백질 용액을 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 여과합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 샘플을 4°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>컬럼 패킹<ol><li>아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 매트릭스 크로마토그래피 컬럼을 5 mL 빈 크로마토그래피 컬럼에 적정량의 라이신-아가로스 매트릭스 배지와 아르기닌-아가로스 매트릭스 배지를 로딩하여 압축한다. 참고: 컬럼은 2-8°C에서 보관할 수 있으며 매트릭스는 저장 완충액(20% 에탄올)에 담글 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>친화성 정제<ol><li>친화성 크로마토그래피 컬럼을 먼저 ddH2O(1mL/분, 10컬럼 부피)로 평형화한 다음 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 8.0, 1mL/분, 5컬럼 부피)으로 평형을 이룹니다.</li>
		<li>단백질 용액 샘플을 사전 평형화된 컬럼(1mL/분, 1/3컬럼 부피)에 로드합니다. 참고: 샘플 로딩의 부피는 sFE의 농도에 따라 다릅니다.</li>
		<li>컬럼을 Tris-HCl 완충액(0.02 M, pH 8.0, 5컬럼 부피)으로 세척합니다.</li>
		<li>0.15 M, 0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M 및 0.65 M NaCl(1 mL/min, 5 컬럼 부피)로 컬럼을 순차적으로 용리합니다.</li>
		<li>0.15M NaCl 용출에 나타나야 하는 용출 피크를 찾은 다음 5mL 튜브에서 분획을 수집합니다.</li>
		<li>용출 시료를 3 kD 초원심 필터(3,944 × g, 1.5 h, 4°C)를 사용하여 농축한다. 나중에 사용할 수 있도록 이 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 순도 평가
<ol><li>소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔 제조<ol><li>5% 농축 겔 및 12% 분리 겔을 사용하여 Laemmli's 방법에 따라 SDS-PAGE 겔을 제조하였다13.</li>
	</ol></li>
	<li>전기영동<ol><li>샘플(15μL)을 5x SDS-PAGE 단백질 로딩 버퍼(1/4 부피)와 혼합하고, 끓는 물에서 5분 동안 가열하고, SDS-PAGE 젤에 로드하고, 80V, 60mA에서 1.5시간 동안 겔을 실행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석<ol><li>전기영동 후 제조사의 프로토콜에 따라 Silver Stain Kit로 겔을 염색하고 화학발광 이미징 시스템을 이용하여 염색된 겔을 관찰합니다.</li>
		<li>다음 공식을 사용하여 표적 단백질의 순도를 분석합니다: 표적 단백질의 순도 = 표적 단백질의 강도 값/총 단백질의 강도 값.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 혈전용해 활성 평가
<ol><li>피브린 플레이트 준비<ol><li>피브리노겐 25mg과 생리식염수 1.25mL를 혼합하여 피브리노겐 용액을 준비합니다.</li>
		<li>트롬빈 100U와 생리식염수 1.05mL를 완전히 혼합하여 트롬빈 용액을 준비한다.</li>
		<li>22.5mL의 Tris-HCl 완충액(0.02mol/L, pH 7.4)에 0.5g의 아가로스를 첨가하여 아가로스 용액을 준비합니다. 완전히 용해될 때까지 100°C에서 아가로스 용액을 혼합하고 가열한다.</li>
		<li>아가로스 용액을 약 50°C로 냉각하고 피브리노겐 용액을 첨가한다. 그런 다음 즉시 트롬빈 용액을 넣고 빠르게 혼합한 다음 60mm 배양 접시에 붓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>로드<ol><li>멸균 천공을 사용하여 준비된 피브린 플레이트에 3mm 웰을 펀칭하고 웰에 10μL 샘플을 채웁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석<ol><li>37°C에서 18시간 배양한 후, 이들의 분해 구역의 크기를 계산하여 혈전용해 활성을 측정한다. 섬유소 용해 활성 = (샘플의 구역 크기/유로키나아제의 구역 크기) x 100U. 구역 크기 = 직경 x 직경. 참고: 생리 식염수 완충액, 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플) 및 유로키나아제를 각각 블랭크, 음성 대조군 및 양성 대조군에 사용했습니다. 유로키나아제와 비교하여 정제된 sFE의 섬유소 용해 활성이 ~19,200U/mL임을 발견했습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

Affinity Chromatography를 통한 Sipunculus nudus 의 Fibrinolytic Enzyme 정제

<ol>
	<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report.">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li><li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England.">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li><li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots.">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li><li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction.">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li><li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmin-antiplasmin+system:+structural+and+functional+aspects.">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li><li>Ge, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus.">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus.">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li><li>Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starase:+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential.">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris:+purification,+identification,+antithrombotic+evaluation,+and+mechanisms+investigation.">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant,+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta.">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).</li><li>. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019)</li><li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus.">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li><li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis.">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li><li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus.">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen.">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin.">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li><li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-chromatographic+purification+of+human+&#945;2-antiplasmin.">Affinity-chromatographic purification of human &#945;2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li><li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors.">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li><li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+plasma/cellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments.">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li><li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+(rt-PA)+from+transgenic+tobacco+plants.">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li><li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

sFE의 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없기 때문에, 현재 사용되는 sFE는 신선한 S. nudus14로부터 추출되었다. 더욱이, 문헌에 보고된 sFE의 정제 절차는 분자량, 등전점, 이온 강도 및 극성과 같은 sFE의 몇 가지 일반적인 특징을 기반으로 하기 때문에 복잡하고 비용이 많이 들었습니다15,16. 현재까지 sFE의 친화성 정제 프로토콜은 보...

혈전증은 특히 Covid-19 세계적 대유행 이후 공중 보건에 대한 주요 위협입니다 1,2. 임상적으로, 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA) 및 유로키나제(UK)와 같은 많은 플라스미노겐 활성제(PA)가 혈전용해제로서 널리 사용되어 왔다. PA는 환자의 플라스미노겐을 활성 플라스민으로 활성화하여 피브린을 분해할 수 있습니다. 따라서, 이들의 혈전용해 효율은 환자의 플라스미노겐 상태에 의해 크게 제한된다 3,4. 메탈로프로테이나제 플라스민(metalloproteinase plasmin) 및 세린 플라스민(serine plasmin)과 같은 섬유소용해제는 혈전을 직접 용해시킬 수 있지만 다양한 플라스민 억제제에 의해 빠르게 비활성화되는 플라스민과 같은 섬유소용해효소(FE)를 포함하는 또 다른 유형의 임상 혈전용해제이다5. 그 후, 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시킬 뿐만 아니라 고대 땅콩 벌레 Sipunculus nudus(sFE)6의 섬유소 용해 효소인 피브린을 직접 분해하여 혈전을 용해시킬 수 있는 새로운 유형의 섬유소 용해제가 보고되었습니다.6. 이 이중기능은 특히 비정상적인 플라스미노겐 상태 측면에서 전통적인 혈전용해제에 비해 sFE에 다른 이점을 부여합니다. 다른 이관능성 혈전용해제7,8,9와 비교하여, sFE는 약물 개발, 특히 경구 약물에 대한 비식품 유래 제제에 비해 안전성을 포함한 몇 가지 이점을 나타낸다. 이는 Sipunculus nudus의 생체 안전성과 생체 적합성이 잘 확립되어 있기 때문입니다10.
미생물, 지렁이 및 버섯으로부터 분리된 다른 천연 섬유소용해제와 유사하게, S. nudus로부터의 sFE의 정제는 매우 복잡하며, 조직 균질화, 황산암모늄 침전, 담수화, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 분자체10,11,12와 같은 여러 단계를 포함한다. 이러한 정화 시스템은 숙련 된 기술과 값 비싼 재료에 의존 할뿐만 아니라 전체 절차를 완료하는 데 며칠이 걸립니다. 따라서 sFE의 간단한 정화 프로그램은 sFE의 추가 개발에 매우 중요합니다. 다행히 sFE의 두 결정(PDB: 8HZP; PDB: 8HZO)를 성공적으로 획득했습니다(보충 파일 1 및 보충 파일 2 참조). 구조 분석 및 분자 도킹 실험을 통해 sFE의 촉매 코어가 아르기닌 또는 라이신 잔기를 포함하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있음을 발견했습니다.
여기서, sFE의 결정구조에 기초한 친화성 정제 시스템이 최초로 제안되었다. 이 프로토콜을 따르면, 단일 친화성 정제 단계에서 미정제 추출물로부터 고순도 및 고활성 sFE를 정제할 수 있습니다. 여기에서 개발된 프로토콜은 sFE의 대규모 제조에 중요할 뿐만 아니라 다른 혈전용해제의 정제에도 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose G-10</td>
			<td>Biowest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Arginine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoxylenol Blue (BPB)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Silver Stain Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Lysine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT Aprotein Purification System pure</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750</td>
			<td>SANYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump BT-100</td>
			<td>QITE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Glass Homogenizer DY89-II</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Decolorization Shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine AF 103</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KQ-500E Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>ShuMei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Zhi wei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Galanz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Desktop pH Meter</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small-sized Vortex Oscillator</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Material&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR Tube (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (7 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Membrane (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (1 mL )</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Indicator Paper</td>
			<td>TZAKZY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH Indicator</td>
			<td>SSS Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of a fibrinolytic enzyme from sipunculus nudus

Sipunculus nudus(sFE)의 섬유소 용해 효소는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화하고 피브린을 직접 분해할 수 있는 새로운 혈전용해제로 기존 혈전용해제에 비해 큰 이점을 보여줍니다. 그러나 구조 정보가 부족하기 때문에 sFE의 모든 정제 프로그램은 너무 복잡하고 비용이 많이 드는 다단계 크로마토그래피 정제를 기반으로 합니다. 여기서, sFE의 친화성 정제 프로토콜은 sFE의 결정 구조를 기반으로 최초로 개발되었습니다. 여기에는 미정제 시료 및 라이신/아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼의 준비, 친화성 정제 및 정제된 sFE의 특성 분석이 포함됩니다. 이 프로토콜에 따라 sFE 배치를 1일 이내에 정제할 수 있습니다. 또한 정제된 sFE의 순도와 활성은 각각 92% 및 19,200U/mL로 증가합니다. 따라서 이것은 sFE 정제를 위한 간단하고 저렴하며 효율적인 접근 방식입니다. 이 프로토콜의 개발은 sFE 및 기타 유사한 제제의 추가 활용에 매우 중요합니다.

Thrombosis is a major threat to public health, especially following the Covid-19 global pandemic1,2. Clinically, many plasminogen activators (PAs), such as tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase (UK), have been widely used as thrombolytic drugs. PAs can activate patients&#39; plasminogen into active plasmin to degrade fibrin. Thus, their thrombolytic efficiency is heavily restricted by the patients&#39; plasminogen status3,4. Fibrinolytic agents, such as metalloproteinase plasmin and serine plasmin, are another type of clinical thrombolytic drug that also include fibrinolytic enzymes (FE) such as plasmin, which can dissolve clots directly but are quickly inactivated by various plasmin inhibitors5. Subsequently, a novel type of fibrinolytic agent has been reported that can dissolve the thrombus by not only activating the plasminogen into plasmin but also degrading the fibrin directly6-the fibrinolytic enzyme from the ancient peanut worm Sipunculus nudus (sFE)6. This bifunction endows sFE other advantages over traditional thrombolytic drugs, especially in terms of abnormal plasminogen status. Compared with other bifunctional fibrinolytic agents7,8,9, sFE displays several advantages, including safety, over non-food derived agents for drug development, especially for oral drugs. This is because the biosafety and biocompatibility of Sipunculus nudus have been well-established10.
Similar to the other natural fibrinolytic agents isolated from microorganisms, earthworms, and mushrooms, the purification of sFE from S. nudus is very complicated and includes multiple stages, such as tissue homogenization, ammonium sulphate precipitation, desalination, anion-exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and molecular sieving10,11,12. Such a purification system not only depends on proficient skills and expensive materials, but also requires several days to complete the whole procedure. Therefore, a simple purification program of sFE is of great significance for the further development of sFE. Fortunately, two crystals of sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) have been successfully obtained (see Supplemental File 1 and Supplemental File 2). Through structural analysis and molecular docking experiments, we found that the catalytic core of sFE could specifically bind to targets containing arginine or lysine residues.
Herein, an affinity purification system was proposed for the first time, based on the crystal structure of sFE. By following this protocol, highly pure and highly active sFE could be purified from the crude extracts in a single affinity purification stage. The protocol developed here is not only important for the large scale preparation of sFE, but also may be applied for the purification of other fibrinolytic agents.

저자 스포트라이트: Sipunculus nudus의 Fibrinolytic Enzyme의 친화성 정제  

Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제

Our research is mainly about the purification of fibrinolytic enzyme. This work tries to establish a simple purification method for fibrinolytic enzyme. In this work, we report an arginine or lysine best-affinity purification system of fibrinolytic enzyme for the first time.Compared with the conventional purification methods, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for the purification of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus. The development of this protocol is of greater significance for the further utilization of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus and other similar agents.

이 프로토콜에 따라, 조조직 용해물을 추출하고, 아르기닌-아가로스 매트릭스 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼을 구축하고, 정제된 sFE를 얻고, 정제된 sFE의 순도 및 섬유소 용해 활성을 각각 SDS-PAGE 및 피브린 플레이트에 의해 측정하였다.
원심분리 후, 수집된 상층액은 투명한 황갈색 점성 액체였다. 침전은 이 상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)...

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여기에서는 간단하고 저렴하며 효율적인 Sipunculus nudus 의 섬유소 용해 효소의 친화성 정제 방법을 제시합니다.

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

우리의 연구는 주로 섬유소 용해 효소의 정제에 관한 것입니다. 본 연구는 혈전용해효소에 대한 간단한 정제방법을 확립하고자 한다. 이 연구에서는 혈전용해효소의 아르기닌 또는 라이신 최적 친화성 정제 시스템을 처음으로 보고합니다.기존의 정제 방법과 비교할 때, 이것은 Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소를 정제하기 위한 간단하고 저렴하며 효율적인 접근 방식입니다. 이 프로토콜의 개발은 Sipunculus nudus 및 기타 유사한 제제의 섬유소 용해 효소의 추가 활용에 더 큰 의미가 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

1.2K 조회수.  Huaqiao University. 우리의 연구는 주로 섬유소 용해 효소의 정제에 관한 것입니다. 본 연구는 혈전용해효소에 대한 간단한 정제방법을 확립하고자 한다. 이 연구에서는 혈전용해효소의 아르기닌 또는 라이신 최적 친화성 정제 시스템을 처음으로 보고합니다.기존의 정제 방법과 비교할 때, 이것은 Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소를 정제하기 위한 간단하고 저렴하며 효율적인 접근 방식...

비디오: 저자 스포트라이트: Sipunculus nudus의 Fibrinolytic Enzyme의 친화성 정제  

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.

연구

생화학

Protein Isolation from Sipunculus nudus

Protein Isolation from Sipunculus nudus  

Begin the sample treatment by dissecting 100 grams of fresh Sipunculus nudus and collecting their intestine and inner fluid.Add 300 milliliters of Tris hydrochloride buffer and homogenize at 1000 RPM for 60 seconds.Freeze thaw the homogenate three times.After centrifuging the freeze thawed homogenate, collect the supernatant and store it at 4

Sipunculus nudus에서 단백질 분리

Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts 

Filter the crude proteins extracted from the Sipunculus nudus intestine through a 0.22-micrometer filter membrane. Store this sample at four degrees Celsius for later use. Pack the arginine agarose matrix affinity chromatography column by loading the arginine agarose matrix medium into a five-milliliter empty chromatography column.Similarly, load the lysine agarose matrix affinity chromatography column by loading the lysine agarose matrix medium into an empty chromatography column. Equilibrate the affinity chromatography columns with double-distilled water followed by tris hydrochloride buffer. Load the filtered protein sample onto the pre-equilibrated column.Wash the column with five volumes of 0.02-molar tris hydrochloride buffer before eluting it with 0.15-0.25-0.35-0.45-0.55-and 0.65-molar sodium chloride solutions, successively. Once the elution peak appears in the 0.15-molar sodium chloride elution, collect the fractions in five-milliliter tubes. Concentrate the elution sample using a three-kilodalton ultracentrifugal filter and store this sample at minus 80 degrees Celsius for later use.When the protein solution was loaded onto the arginine agarose matrix affinity column, the flow-through peak appeared from approximately 40 to 66 minutes. In the gradient elution stage, elution with 0.15-molar sodium chloride peaked from approximately 94 to 110 minutes. When the protein solution was loaded to the lysine agarose matrix affinity column, the flow-through peak appeared from approximately 38 to 60 minutes.In the gradient elution stage, elution with 0.15-molar sodium chloride peaked from 80 to 86 minutes.

친화성 크로마토그래피 매개 섬유소 용해 효소 조단백질 추출물 정제 

Fibrinolytic Activity of the Fibrinolytic Enzyme Purified from Sipunculus nudus

Fibrinolytic Activity of the Fibrinolytic Enzyme Purified from  Sipunculus nudus  

Begin the fibrin plate preparation by mixing 25 milligrams of fibrinogen with 1.25 milliliters of physiological saline. Next, prepare the thrombin solution by thoroughly mixing 100 units of thrombin with 1.05 milliliters of physiological saline. Then, prepare the agarose solution by adding 0.5 grams of agarose to 22.5 milliliters of 0.02 molar Tris-hydrochloride acid buffer.Heat the agarose solution at 100 degrees Celsius until it dissolves completely. Cool the agarose solution to around 50 degrees Celsius before adding the fibrinogen solution to it. Immediately add the thrombin solution, mix rapidly, and pour the mixture into a 60-millimeter culture dish.To load the sample, punch three-millimeter wells into the fibrin plates using a sterile Boer, and fill them with 10 microliters of samples. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for 18 hours before measuring the size of their degrading zones and calculating the fibrinolytic activity. Fibrinolytic activity evaluation showed a 1.3-centimeter lysing zone in the urokinase control, no lysing zone in the physiological saline buffer, 2.1 centimeters of the lysing zone in the crude protein well, and 1.8 centimeters diameter of the lysing zone in the purified fibrinolytic enzyme well.