이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81930031, 81901525)의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 기계 및 기술 지침을 제공해 주신 Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.에 감사드립니다.

인체 검체 채취는 천진 의과대학 종합병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다. 인간 정맥혈 채취는 중국 국가위생건강위원회에서 발행한 지침, 즉 WS/T 661-2020 정맥혈 표본 채취 지침을 엄격히 따랐습니다. 간단히 말해서, 전방 상완 부위 정맥에서 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액을 수집하고, 샘플을 3.2% 구연산나트륨 항응고제를 1:9의 비율로 혼합했습니다. 구연산나트륨 항응고제 검체만 채취했을 때, 첫 번째 채취 용기는 폐기되었습니다. 처리 흐름은 샘플 수집 후 0.5시간 이내에 시작되었습니다. 건강한 성인 피험자는 정보에 입각한 동의를 얻은 후 샘플 수집을 위해 모집되었습니다. 환자 제외 기준은 (1) 최근 혈관 내 혈전증, (2) 간 및 신장 기능 장애, (3) 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 및 기타 만성 질환, (4) 아스피린 또는 항응고제 치료, (5) 월경 및 임신이었습니다.
1. EV가 풍부한 플라즈마의 분리
<ol><li>샘플을 실온에서 120 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 혈액 세포를 제거합니다. 상청액은 혈소판이 풍부한 혈장입니다. 그런 다음 상층액의 상부 1/2을 피펫이 있는 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>혈소판이 풍부한 혈장을 실온에서 1500 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 혈소판을 제거합니다. 상청액은 혈소판이 부족한 혈장입니다. 그런 다음 상층액의 상부 1/2을 새 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>혈소판이 부족한 혈장을 실온에서 13000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 상층액은 EV가 풍부한 혈장입니다. 그런 다음 후속 테스트를 위해 상층액의 상부 1/2을 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
</ol>2. 분석기에 의한 시료의 EV-ACT 검출
<ol><li>응고 분석기( 재료 표 참조)를 켜고 기기를 37°C로 예열합니다. 일회용 프로브와 테스트 컵을 설치한 다음 기계의 품질 관리 절차를 시작합니다. 알림: 화면에 점성 저항 신호 값이 직선으로 표시되면 감지가 방해받지 않고 분석기 상태의 품질 관리가 자격이 있음을 의미합니다. 자체 테스트가 검증된 후 테스트 절차를 시작할 수 있습니다.</li>
	<li>시스템에 샘플 정보를 입력합니다. 그런 다음 200μL의 EV가 풍부한 혈장을 테스트 컵으로 옮긴 다음 20mM 170μL의 염화칼슘을 옮깁니다. 시작 버튼을 클릭합니다. 테스트 컵의 자석 교반 막대는 샘플과 염화칼슘을 완전히 혼합합니다. 덮개를 닫으면 프로브가 샘플 저항의 변화를 감지하기 시작합니다. 알림: 테스트가 완료되면 분석기에서 자동으로 "테스트 완료"라는 메시지를 표시합니다. EV-ACT 시간이 시스템에 의해 표시되고 기록됩니다. 결과는 시간 단위 "초"로 표현됩니다. 프로브를 버리고 컵을 테스트하십시오.</li>
</ol>3. EV가 풍부한 혈장 샘플의 유세포 분석 기반 품질 관리
<ol><li>EV는 먼저 크기(0.1-1μm)로 식별되었습니다. 유세포 분석기의 파라미터를 미리 조정하고 시판되는 폴리스티렌 비드(0.5, 0.9 및 3.0μm)를 사용하여 EV의 "게이트"를 설정합니다( 재료 표 참조). 참고: 비드 혼합물은 미세소포(0.5 및 0.9μm)와 혈소판(0.9μm 및 3μm)의 크기 범위를 포괄하는 다양한 직경의 형광 구체로 구성됩니다.</li>
	<li>전방 산란과 측면 산란의 전압을 조정하고 0.9μm 마이크로스피어가 적절한 영역에 속하는지 확인합니다. EV 영역은 마이크로스피어의 직경에 따라 그릴 수 있습니다.</li>
	<li>50μL의 EV가 풍부한 혈장을 플로우 튜브로 옮긴 다음 450μL의 여과된 인산염 완충 식염수를 전달합니다. 플로우 튜브에 액체를 완전히 혼합하십시오. 마지막으로, 유세포 분석(25)을 이용하여 샘플들을 검출한다.</li>
	<li>Ultra Rainbow Fluorescent Particles( 재료 표 참조)를 사용하여 브리프의 EVs.In 수를 정량화하고, 유동 검출 전에 샘플에 10μL의 입자를 추가하고, 샘플 검출이 완료된 후 10,120 * EV (#) / (마이크로비즈 * 부피) * 희석 계수26 공식을 사용하여 EV 농도를 계산합니다.</li>
</ol>

EV-Rich Plasma의 혈액 과응고 평가

<ol>
	<li>Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulopathy+induced+by+traumatic+brain+injury:+systemic+manifestation+of+a+localized+injury.">Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury.</a> Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).</li><li>Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. 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I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preeclampsia+and+Extracellular+Vesicles.">Preeclampsia and Extracellular Vesicles.</a> Current Hypertension Reports. 18 (9), 68 (2016).</li><li>Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+exosomes+in+the+therapy+of+the+cartilage+and+bone+complications;+emphasis+on+osteoarthritis.">The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis.</a> Life Science. 236, 116861 (2019).</li><li>Shi, J., Gilbert, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactadherin+inhibits+enzyme+complexes+of+blood+coagulation+by+competing+for+phospholipid-binding+sites.">Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites.</a> Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).</li><li>Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+endothelial+locus-1+(Del-1)+mediates+clearance+of+platelet+microparticles+by+the+endothelium.">Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium.</a> Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).</li><li>Frey, B., Gaipl, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+functions+of+phosphatidylserine+in+membranes+of+dying+cells+and+microvesicles.">The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles.</a> Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).</li><li>Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+removal+by+single-step+centrifugation.">Platelet removal by single-step centrifugation.</a> Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+placenta-derived+extracellular+vesicles+with+pre-eclampsia+and+associated+hypercoagulability:+a+clinical+observational+study.">Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study.</a> BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+applications+of+microparticles+in+the+diagnosis,+treatment,+and+prognosis+of+lung+cancer.">The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).</li><li>Piwkham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+red+blood+cell+microvesiculation+exerts+procoagulant+activity+of+blood+cell+storage+in+Southeast+Asian+ovalocytosis.">The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis.</a> Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).</li><li>Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+clot+based+assay+for+detection+of+procoagulant+cell-derived+microparticles.">A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).</li></ol>

모든 저자는 잠재적인 이해 상충이 없다고 선언했습니다.

이 연구에서는 EV가 풍부한 혈장의 제조를 설명하고 유세포 분석을 사용하여 방법의 합리성을 검증했습니다. 이어서, 재석회화된 혈장 샘플은 점탄성 원리24에 기초한 응고 분석기를 사용하여 ACT 시간 동안 분석하였다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 초원심분리를 통해 얻은 EV의 농도는 EV-ACT 시간을 단축하는 것으로 나타났으며, EV 수준을 감소시킨 초원심분리 ?...

혈액 응고 과잉에 의해 발생하는 혈전증은 뇌 외상(brain trauma)1, 자간전증(pre-eclampsia)2, 종양(tumors)3, 골절 환자(fracture patients)4 등 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다. 과응고성의 기전은 복잡하며, 최근에는 응고 장애에서 세포외 소포체(EV)의 역할이 강조되고 있습니다. EV는 직경이 10nm에서 1000nm에 이르는 세포막에서 분리되는 이중층 구조를 가진 소포 모양의 몸체입니다. 이는 다양한 질병 과정, 특히 응고 장애와 관련이 있다5. 여러 연구에서 EV가 혈전증 위험의 유망한 예측 인자로 확인되었습니다 6,7. EV의 응고 활성은 응고 인자, 주로 조직 인자(TF)와 포스파티딜세린(PS)의 발현에 따라 달라집니다. 강력한 프로응고제 활성을 가진 EV는 테나아제와 프로트롬빈 복합체의 촉매 효율을 크게 향상시켜 트롬빈 매개 피브리노겐과 국소 혈전증을 촉진한다8. EV의 높은 수준과 과응고성과의 인과 관계는 수많은 질병에서 관찰되었다9. 결과적으로, EV의 검출을 표준화하고 그들의 응고제 활성을 보고하는 것은 중요한 조사 영역이다10.
현재까지 EV의 응고 활성을 감지하는 데 사용할 수 있는 상용 키트는 소수에 불과합니다. 상업 회사에서 생산한 MP-활성 분석 및 MP-TF 분석은 혈장11에서 EV의 응고제 활성을 측정하는 데 사용되는 기능 분석입니다. 이 분석은 효소 결합 면역 흡착 분석과 유사한 원리를 사용하여 EV에서 PS 및 TF를 검출합니다. 그러나 이러한 키트는 비싸고 소수의 고급 연구 기관으로 제한됩니다. 이 프로세스는 복잡하고 시간이 많이 걸리기 때문에 임상 환경에서 구현하기가 어렵습니다. 또한, 상업적으로 개발된 프로코아응고제 인지질(PPL) 분석은 PS-free 혈장과 테스트 혈장을 혼합하여 응고 시간을 측정하여 PS 양성 EV의 수준을 정량적으로 검출한다12. 그러나 이러한 분석은 주로 EV의 PS 및 TF에 초점을 맞추고 순환 EV가12에 관여할 수 있는 다른 응고 경로를 간과합니다.
혈장 응고 시스템은 복잡하며 응고제, 항응고제, 섬유소 용해 시스템 및 혈장에 부유하는 EV를 포함하여 "보이지 않는" 구성 요소와 "보이는" 구성 요소로 구성됩니다. 생리학적으로 이러한 구성 요소는 동적 균형을 유지합니다. 병리학적 상태에서, 순환 중인 EV의 현저한 증가는 특히 뇌 외상, 자간전증, 골절 및 다양한 유형의 암 환자에서 과응고에 기여한다13. 현재 임상 실험실에서 응고 상태를 평가하는 것은 주로 응고 시스템, 항응고 시스템 및 섬유소 용해를 평가하는 것을 포함합니다 14,15,16,17. 프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 트롬빈 시간 및 국제 정규화 비율은 일반적으로 응고 시스템18에서 응고 인자 수준을 평가하는 데 사용된다. 그러나 최근 연구에 따르면 이러한 검사는 특정 질병의 과응고 가능성을 완전히 반영하지 못한다19. 혈전 탄성 측정법(TEG), 회전 TEG 및 소노클로트 분석과 같은 다른 분석 방법은 전혈 점탄성 변화를 측정합니다20,21. 전혈 샘플에는 수많은 혈액 세포와 혈소판이 포함되어 있기 때문에 이러한 검사는 샘플 전체의 응고 상태를 나타낼 가능성이 더 큽니다. 일부 연구자들은 혈액 세포와 혈소판이 응고제 활성에서 차지하는 역할에 대해 보고했습니다 22,23. 최근 연구에서는 이전의 응고 기능 검사가 미세입자의 응고 활성의 변화를 감지하는 데 어려움을 겪는다는 사실도 발견했다24. 따라서 EV가 풍부한 혈장에서 활성화된 응고 시간(ACT)의 점탄성 측정으로 EV의 응고 기능을 평가할 수 있다는 가설이 제안되었습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles</td>
			<td>3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>For quantitative detection of MP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Werfen (china)</td>
			<td>0020006800</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Century Clot analyzer</td>
			<td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable probe and test cup</td>
			<td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Used to detect MP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megamix polystyrene beads</td>
			<td>Biocytex, Marseille, France</td>
			<td>7801</td>
			<td>The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 &#181;m, 0.9 &#181;m and 3 &#181;m.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the procoagulant activity of extracellular vesicle (ev) using ev-activated clotting time (ev-act)

다양한 질병에서 세포외 소포체(EV)의 역할은 특히 강력한 응고 활성으로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다. 그러나 임상 환경에서 EV의 응고 활성을 평가하기 위한 병상 검사가 시급히 필요합니다. 이 연구는 EV의 응고제 활성의 척도로 EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간을 사용할 것을 제안합니다. 나트륨 구연산 전혈을 얻기 위해 표준화된 절차를 사용한 후 EV가 풍부한 혈장을 얻기 위해 차등 원심분리를 수행했습니다. EV가 풍부한 플라즈마와 염화칼슘을 테스트 컵에 첨가하고 분석기를 사용하여 점탄성의 변화를 실시간으로 모니터링했습니다. EV-ACT라고 하는 EV가 풍부한 혈장의 자연 응고 시간을 측정했습니다. 그 결과, 건강한 지원자로부터 얻은 혈장에서 EV를 제거했을 때 EV-ACT가 크게 증가한 반면, EV가 농축되었을 때 EV-ACT가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, 자간전증, 고관절 골절 및 폐암의 인간 샘플에서 EV-ACT가 상당히 단축되어 혈장 EV 수치가 상승하고 혈액 과응고가 촉진되었음을 나타냅니다. 간단하고 빠른 시술을 통해 EV-ACT는 혈장 EV 수치가 높은 환자의 응고 기능을 평가하기 위한 병상 검사로서 가능성을 보여줍니다.

Thrombosis, which is caused by hypercoagulability, plays a significant role in various diseases, including brain trauma1, pre-eclampsia2, tumors3, and fracture patients4. The mechanism underlying hypercoagulability is complex, and recent emphasis has been placed on the role of extracellular vesicles (EV) in coagulation disorders. EVs are vesicle-like bodies with a bilayer structure that detach from the cell membrane, ranging in diameter from 10 nm to 1000 nm. They are associated with a variety of disease processes, particularly coagulation disorders5. Several studies have identified EVs as a promising predictor of thrombosis risk6,7. The procoagulant activity of EVs depends on the expression of coagulation factors, primarily tissue factor (TF) and phosphatidylserine (PS). EVs with robust procoagulant activity significantly enhance the catalytic efficiency of tenase and prothrombin complex, thereby promoting thrombin-mediated fibrinogen and local thrombosis8. Elevated levels of EVs and their causal relationship with hypercoagulability have been observed in numerous diseases9. Consequently, standardizing the detection of EVs and reporting their procoagulant activity is an important area of investigation10.
To date, only a few commercial kits are available for detecting the procoagulant activity of EVs. The MP-Activity assay and the MP-TF assay, produced by a commercial company, are functional assays used to measure EV&#39;s procoagulant activity in plasma11. These assays employ a principle similar to that of enzyme-linked immunosorbent assays to detect PS and TF on EVs. However, these kits are expensive and limited to a few high-level research institutions. The process is complex and time-consuming, making it challenging to implement them in clinical settings. Additionally, a commercially developed procoagulant phospholipid (PPL) assay mixes PS-free plasma with test plasma, measuring clotting time to quantitatively detect levels of PS-positive EVs12. However, these assays primarily focus on PS and TF on EVs, overlooking other clotting pathways that circulating EVs may be involved in12.
The plasma coagulation system is intricate and comprises both &#34;invisible&#34; and &#34;visible&#34; components, including coagulants, anticoagulants, fibrinolytic systems, and EVs suspended in the plasma. Physiologically, these components maintain a dynamic balance. In pathological conditions, significantly increased EVs in circulation contribute to hypercoagulability, particularly in patients with brain trauma, preeclampsia, fractures, and various types of cancer13. Currently, the evaluation of coagulation status in clinical laboratories primarily involves assessing the coagulation system, anticoagulation system, and fibrinolysis14,15,16,17. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, thrombin time, and international normalized ratio are commonly used to evaluate coagulation factor levels in the coagulation system18. However, recent studies have revealed that these tests do not fully reflect the hypercoagulability of certain diseases19. Other assay methods, such as thromboelastometry (TEG), rotational TEG, and Sonoclot analysis, measure whole-blood viscoelastic changes20,21. Since whole blood samples contain numerous blood cells and platelets, these tests are more likely to indicate the clotting status of the sample as a whole. Some researchers have reported on the role of blood cells and platelets in procoagulant activity22,23. A recent study also discovered that previous coagulation function tests face difficulties in detecting changes in microparticles&#39; procoagulant activity24. Therefore, a hypothesis has been proposed that the procoagulant function of EVs can be evaluated by viscoelastic measurements of the activated clotting time (ACT) in EV-rich plasma.

저자 스포트라이트: 외상성 뇌 손상 환자의 응고 장애 해독 

EV-ACT(Activated Clotting Time)를 사용한 세포외 소포(EV)의 응고 활성 측정

Our primary focus is on coagulation disorders in patients who have suffered brain trauma. In this study, we try to monitor changes in the clotting function with extracellular vesical activity clotting time. Our teams put attention on the research of brain injury.And in the brain injury, they are a severe condition we call the hyper coagulated state. It's very difficult to measure. And we find in the blood of patient there are some micro vesicle we called extracellular vesicles, including the apoptosis body, micro vesicle, and exosome.And they are different in the pro coagulated ability. So we must find a method to measure the ability. And this method, we can acute quickly to find the difference of the extracellular vesicles.That's very important. Depend on this measure, we can do many things. We have make sure it in the TPI mice, and the clinical patient, especially in the peripheral circulation, it will cost some embolization.That is very, very serious in the clinical. Our protocol offered a significant advantage compared to other techniques due to its simplicity, cost effectiveness, and speed. It allows for a blood clotting test to be conducted at the bedside, eliminating the need for extensive laboratory processing.Our research have established a new method that can measure the hyper coagulated states of the peripheral blood. It can be used not only in the TPI, we can also used in other disease such as sepsis, pre-eclampsia, tumor, and hematology disease. In the future, we have planned to investigated the of in scanning for clinical hyper a condition that increases the risk of blood clot.

EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간은 혈장 응고 시간 측정을 위해 점탄성 방법 분석기를 사용하여 측정하였다. 이 기계는 전자 신호 변환기, 프로브, 감지 탱크 및 발열체의 네 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다(그림 1A,B). 프로브는 고주파 및 저진폭 진동을 활용하여 플라즈마 점도의 변화를 감지합니다. 일상적인 품질 관리에는 주로 테스트 플랫폼의 안정...

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering Coagulation Disorders in Traumatic Brain Injury Patients at JoVE.com

이 프로토콜은 EV의 응고 능력의 지표로 세포외 소포체(EV)가 풍부한 혈장의 사용을 조사합니다. EV가 풍부한 플라즈마는 차등 원심분리 및 후속 재석회화 과정을 통해 얻어집니다.

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. ...

우리의 주요 초점은 뇌 외상을 입은 환자의 응고 장애에 있습니다. 이 연구에서는 세포외 방광 활동 응고 시간에 따른 응고 기능의 변화를 모니터링하려고 합니다. 우리 팀은 뇌 손상 연구에 주목합니다.그리고 뇌 손상의 경우, 우리는 과응고 상태라고 부르는 심각한 상태입니다. 측정하기가 매우 어렵습니다. 그리고 환자의 혈액에는 세포사멸체(apoptosis) 몸체, 미세소포(micro vesicle), 엑소좀(exosome)을 포함하여 세포외 소포(extracellular vesicle)라고 부르는 미세 소포가 있습니다.그리고 그들은 프로 응고 능력이 다릅니다. 그래서 우리는 능력을 측정할 수 있는 방법을 찾아야 합니다. 그리고 이 방법을 사용하면 세포외 소포의 차이를 빠르게 찾을 수 있습니다.그것은 매우 중요합니다. 이 조치에 따라 우리는 많은 일을 할 수 있습니다. 우리는 TPI 마우스와 임상 환자, 특히 말초 순환에서 약간의 색전술이 필요하다는 것을 확인했습니다.이는 임상에서 매우 심각한 문제입니다. 우리의 프로토콜은 단순성, 비용 효율성 및 속도로 인해 다른 기술에 비해 상당한 이점을 제공했습니다. 이를 통해 병상에서 혈액 응고 검사를 수행할 수 있으므로 광범위한 실험실 처리가 필요하지 않습니다.우리의 연구는 말초 혈액의 과응고 상태를 측정할 수 있는 새로운 방법을 확립했습니다. TPI뿐만 아니라 패혈증, 자간전증, 종양 및 혈액 질환과 같은 다른 질병에도 사용할 수 있습니다. 앞으로 우리는 혈전의 위험을 증가시키는 임상 하이퍼 질환을 스캔할 때 OF를 조사할 계획입니다.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT)

546 조회수.  Tianjin Medical University General Hospital. 우리의 주요 초점은 뇌 외상을 입은 환자의 응고 장애에 있습니다. 이 연구에서는 세포외 방광 활동 응고 시간에 따른 응고 기능의 변화를 모니터링하려고 합니다. 우리 팀은 뇌 손상 연구에 주목합니다.그리고 뇌 손상의 경우, 우리는 과응고 상태라고 부르는 심각한 상태입니다. 측정하기가 매우 어렵습니다. 그리고 환자의 혈액에는 세포사멸체(apoptosis) 몸체, 미세소포...

비디오: 저자 스포트라이트: 외상성 뇌 손상 환자의 응고 장애 해독 

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. However, there is an urgent need for a bedside test to assess the procoagulant activity of EV in clinical settings. This study proposes the use of thrombin activation time of EV-rich plasma as a measure of EV's procoagulant activity. Standardized procedures were employed to obtain sodium-citrated whole blood, followed by differential centrifugation to obtain EV-rich plasma. The EV-rich plasma and calcium chloride were added to the test cup, and the changes in viscoelasticity were monitored in real-time using an analyzer. The natural coagulation time of EV-rich plasma, referred to as EV-ACT, was determined. The results revealed a significant increase in EV-ACT when EV was removed from plasma obtained from healthy volunteers, while it significantly decreased when EV was enriched. Furthermore, EV-ACT was considerably shortened in human samples from preeclampsia, hip fracture, and lung cancer, indicating elevated levels of plasma EV and promotion of blood hypercoagulation. With its simple and rapid procedure, EV-ACT shows promise as a bedside test for evaluating coagulation function in patients with high plasma EV levels.

This protocol investigates the use of extracellular vesicle (EV)-rich plasma as an indicator of the coagulative ability of EV. EV-rich plasma is obtained through a process of differential centrifugation and subsequent recalcification.

연구

의학

Isolation of Extracellular Vesicle (EV)-Rich Plasma from Human Blood and Detection of Activated Clotting Time 

To begin, centrifuge the human blood at 120 G for 20 minutes at room temperature to remove the blood cells. Then transfer the upper half of the supernatant to a new tube. Next, centrifuge the platelet rich plasma to remove the platelets, and transfer the upper half of the supernatant to a new tube.Then remove the cell debris by centrifuging the platelet to our plasma at 13, 000 G for two minutes. Transfer the upper half of the supernatant to a new tube. Turn on the clot analyzer to detect extracellular vesicle, or EV activated clotting time, and preheat the instrument to 37 degrees Celsius.Install the disposable probe and test cup. Then start the quality control procedure of the machine. After the quality control run, enter sample information into the system.Then add 200 microliters of EV-rich plasma to the test cup, followed by 20 millimolar, 170 microliters of calcium chloride. Click the start button, close the cover, and allow the probe to detect the change in sample resistance. The unqualified EV samples exhibit a distinct cluster with a slightly larger particle size near the gate of EV.In contrast, qualified EV-rich samples showed most signals within the gate of EV as a single group.An increase in EV concentration shortened EV activated clotting time, while a decrease in EV concentration prolonged EV activated clotting time. EV-rich plasma samples from patients with preeclampsia, hip fractures, and lung cancer had significantly shorter EV activated clotting time compared to healthy volunteers.