이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (SNSF, 보조금 번호 320030_156193)에 의해 지원 되었다. 저자 박사 Benoît Werlen Biosilon microcarrier 비즈 제공 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 한스 피터 Kohler와 교수 안 드레 Haeberli microcarrier 구슬 모델을 설정 하는 방법에 대 한.

독일 Landrace 돼지는 (야생 타입 지역 농가에서 사육 하 고 유전자 변형 동물 사육 분자 연구소와 생명 공학, 루드비히 막시밀리안 대학, 뮌헨, 독일에서 자란), 무게 40 k g, 30 킬로그램 사이 사용 되었다 이 연구는. 모든 동물이 물과 음식을 임의로 광고와 표준 조건 하에서 보관 되어 있었다. 모든 동물 실험은 스위스 동물 보호 법률 뿐만 아니라 치료와 실험 동물의 사용에 대 한 영국 동물 (과학적인 절차) 고 NIH 가이드에 따라 수행 했다. 모든 동물 연구 도착 지침 준수. Cantonal 수의학 서비스 (구획의 베른, 스위스)의 동물 실험 위원회 아니 모든 동물 절차를, 허가 승인 했다. BE70/14입니다. 실험 프로토콜 3R 원칙에 따라 세련 되었고 최신의 마 취와 통증 관리 동물의 수를 최소화 하 고 실험 하는 동안 스트레스와 통증을 동물의 노출을 줄일 하는 데 사용 했다.
 피는 건강 한 개인에서 베른 대학 병원의 스위스 관할 및 윤리 지침에 따라 폐쇄 시스템 venipuncture에 의해 그려진 했다. 문구 &#34; anticoagulated 비 혈액 &#34; 어떤 응고 제와 혈액은 치료 되지 의미.
 다음 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다. 기본 셀 문화 무 균 기법으로 친숙이 필요.
 1. 절연의 PAEC 참고: 6 ~ 10 cm의 흉부 대동맥 세그먼트 3 ~ 6 개월의 나이 (다른 vivo에서 실험을 위해 사용)의 즉시 안락사 독일 Landrace 돼지에서 가져온 포함 하는 전송 매체 (DMEM + 1% 페니실린/스) 500 mL 유리병으로 옮겨.
<ol><li>미리 fibronectin 12.5 µ g/mL PBS 1와 6 잘 플레이트 코트 x 1 h. 위해 37 ° C에는 인큐베이터에 배치</li>
	<li>미리 따뜻한 무 균 PBS 1 x와 셀 문화 매체 (DMEM).</li>
	<li>전송 매체에서 돼지 대동맥 꺼내.</li>
	<li>폴리스 티 렌 격판덮개에 대동맥 장소.</li>
	<li>부드럽게 미리 따뜻한 PBS를 가진 플러시.</li>
	<li>경도 대동맥을 잘라 고 바늘으로 수정.</li>
	<li>내부 용기 표면에 따뜻한 세포 배양 매체 추가.</li>
	<li>Fibronectin 세포 배양 매체를 발음 하 고 신선한 세포 배양 매체 (DMEM 10 %FBS와 1% 페니실린/스 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 보충) 추가.</li>
	<li>세포 배양 매체에서 한 면봉을 담근 다. 같은 방향으로 부드럽게 그리고 천천히 맨 내부 용기 표면에 목화 꽃 봉 오리를 면봉.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 한 잘에 셀 라운드 라운드 문.</li>
	<li>우물의 나머지 부분에 대 한 동일한 작업을 수행.</li>
	<li>현미경 세포를 확인 하 고 37 ° c, 5% CO 2 배양 기에서 6-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>둘째 날에는 매체를 변경 하 고 다시 2-3 일 마다 변경.</li>
	<li>셀 confluent 될 거 야, trypsinize 셀 고 T75 플라스 크 (PAEC P1)으로 씨앗.</li>
</ol> 2. PAEC 특성화 <ol><li>미리 코트 fibronectin 12.5 µ g/mL PBS 1와 8 잘 chamberslide x 1 h. 위해 37 ° C에는 인큐베이터에 배치</li>
	<li>5 x 10 4 셀/잘 씨와 37에 인큐베이터에서 밤새 품 어 ° c.</li>
	<li>PBS + + (PBS CaCl 2와 MgCl 2 보충), 두 번 셀 세척 300 μ/잘.</li>
	<li>실내 온도에, 200 μ/잘 10 분 3.7 %paraformaldehyde 셀 수정.</li>
	<li>셀 3 회 PBS + +, 300 μ/잘 씻어.</li>
	<li>PBS 1 x-3_% BSA (블로킹 버퍼)의 300 μ를 추가 하 고 실 온에서 30 분 두고.</li>
	<li>1 차 항 체 (안티-VE-cadherin, 안티 CD31, 안티-vWF) PBS 1x-1%BSA-0.05% 세제, 160 μ/잘에에서 희석 적용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>PBS + + (200 μ/잘)를 가진 3 번 세척.</li>
	<li>이차 항 체와 DAPI에서 PBS 1x-1%BSA-0.05% 세제, 160 μ, 잘 희석 적용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>PBS + + (200 μ/잘)를 가진 3 번 세척.</li>
	<li>글리세롤 기반된 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 하 고 내 피 세포 마커 식 형광 현미경 확인. 
	참고: 90% 합류까지 T175 플라스 크 (DMEM 낮은 포도 당 매체 + 10 %FBS, 1% 페니실린/스와 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4%)에 문화 돼지 대동맥 내 피 세포에 도달. (시드 밀도 1 x 10 6 셀, 90% 합류 해당 약 5 x 10 6 셀).</li>
</ol> 3. Microcarrier 구슬의 코팅 <ol><li>콜라겐 솔루션 50 mL 튜브 (100 μ g/mL, 0.2% 초 산 용액에 희석)의 42 mL와 함께 microcarrier 구슬의 7 mL를 혼합 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>구슬 두 번 PBS pH 7.4의 25 mL로 씻고 (25 mL PBS의 추가, 잘와 함께 혼합에 피펫으로 상쾌한 및 반복 구슬 다음 삭제 정착은 될 때까지 기다립니다) DMEM 매체의 25 mL와 함께 한 번.</li>
	<li>커버 매체 199 10% 보충의 10 mL 50 mL 튜브에 구슬 FBS, 1% 페니실린/스, 1 %L-글루타민, 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 및 25 μ 헤 파 린 (5000 IU/mL)의 10 분에 대 한 평형 수 더 사용 하기 전에.</li>
</ol> 4. 세포를 수집 <ol><li>PAEC 포함 된 T175 플라스 크에서 세포 배양 매체를 제거 하 고 PBS pH 7.4의 5 mL을 추가.</li>
	<li>T175 플라스 크에서 PBS 제거.</li>
	<li>Trypsin-0.05% EDTA의 5 mL을 추가 하 고 37에서 3-4 분 동안 품 어 ° c.</li>
	<li>세포 배양 매체의 15 mL로 플라스 크를 rinsing 하 여 세포를 수집 하 고 전송 50 mL 튜브에 서 스 펜 션.</li>
	<li>실 온에서 8 분 1200 x g에서 세포를 원심 초과 매체를 제거 하 고 세포 배양 매체의 5 ml에서는 펠 릿 resuspend.</li>
</ol> 5. 활동가 플라스 크로 셀 시드 <ol><li>세포 현 탁 액을 세포 배양 매체의 20 mL를 추가 하 고 resuspend.</li>
	<li>자력 500 mL 플라스 크에 20 mL 세포 배양 (세포) 제외 추가.</li>
	<li>단계 3.3에서에서 씻어 microcarrier 구슬에 셀을 추가 하 고 신중 하 게 25 mL 혈 청 학적인 피 펫 혼합.</li>
	<li>자석 스피너 플라스 크에 구슬/셀 혼합 전송.</li>
	<li>나머지 수집 하 세포 배양 매체의 10 mL 50 mL 튜브 린스.</li>
	<li>스피너 플라스 크에 세포 배양 매체의 추가적인 85 mL를 추가 하 고 통에 37 ° C에서 하룻밤 인큐베이터에 배치 (100 x g, 혼합 간격: 3 분 마다 45 분).</li>
	<li>세포 배양 매체의 50 mL를 추가 (전체 용량 200ml) 추가 24 h에 대 한 교 반 통에 37 ° C에서 계속 (100 x g, 혼합 간격: 3 분 마다 45 분).</li>
	<li>추가 무색 RPMI 매체 (보충 10 %FBS, 1% 페니실린/스, 1 %L-글루타민, 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 및 헤 파 린의 25 μ) 320 mL 전체 볼륨에 도달할 때까지.</li>
	<li>대체 매체 오래 된 매체의 모든 48 h: 제거 100 mL 및 100 mL 신선한 보충된 무색 RPMI의 추가.</li>
	<li>5 ~ 7 일에 대 한 셀을 문화. 시간 셀 코팅 구슬의 합류 상태에 따라 달라 집니다.</li>
</ol> 6. 합류 확인 <ol><li>는 피 펫을 사용 하 여 셀 코팅 구슬의 200 μ를 수집 하 고 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>세척 3 회 PBS 1의 600 μ와 구슬 x (PBS, 추가 기울기는 튜브 셀의 분리를 피하기 위해, 구슬 대기를 부드럽게 혼합 정착, PBS 삭제 및 반복).</li>
	<li>Parapicric 산의 200 μ를 추가 하 여 10 분 동안 구슬 해결.</li>
	<li>X. PBS 1의 600 μ로 3 번 세척</li>
	<li>추가 DAPI에서 PBS 1 희석 x 10 분에 대 한 품 어 및</li>
	<li>구슬 유리 슬라이드에 전송과 coverslip 글리세롤 기반 설치 매체를 사용 하 여 적용.</li>
	<li>Confocal 현미경 구슬 시각화.</li>
</ol> 7. 실험 절차 <ol><li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 셀 코팅 구슬 (절차 없는 메 마른 조건 하에서 해야 할) 자력 플라스 크에서 제거 하 고 12 mL 라운드-하단 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>구슬과 정착 (약 1-2 분) 초과 매체를 제거 하자.</li>
	<li>구슬의 정확히 2 mL를 포함 하는 모든 튜브까지 관에 더 많은 구슬을 추가.</li>
	<li>5 mL 분명 RPMI 각 튜브를 추가 하 고 신중 하 게 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 혼합.</li>
	<li>구슬과 정착 초과 매체를 제거 하자.</li>
	<li>RPMI와 한 번 더 세척 절차를 반복 하 고 모든 초과 매체 제거.</li>
</ol> 8. 보육 비-anticoagulated 피 <ol><li>신중 하 고 천천히 (를 사용 하 여 jet도 vacutainers) 혈액 건강 한 지원자에서 그리고 9 mL 중립 폴 리 프로필 렌 튜브 (응고 제)에서 수집.</li>
	<li>천천히 각 셀 코팅 구슬 (10 mL 전체 볼륨 것입니다)의 2 개 mL를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 튜브에 8ml 혈액 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과의 전송 합니다. 항상 혈액 또는 조기 EC 활성화를 피하기 위해 구슬의 거친 처리를 하지 마십시오. 절차 1-2 분 소요</li>
	<li>신중 하 게 동등한 혼합 및 파라핀 필름 뚜껑을 밀봉 하 피/비드 혼합물을 기울기.</li>
	<li>수평 틸팅 테이블 (부드러운 기울기 설정만) 37 ° C 배양 기 및 기록 시간을 응고 내부에 튜브를 놓습니다.
	<ol><li>설정된 시간 간격 예: 10, 20, 30, 50, 70, 90 분, 후 혈 청 또는 플라스마 분석을 위한 혈액 비드 혼합물의 1.5-2 mL 이상 제거. 
		참고: 6 시간 점 좋습니다 셀의 한 그룹 내에서 3 개 이상의 복제 데로 다른 튜브에 혈액 샘플링을 할 수.</li>
		<li>혈 청의 컬렉션에 대 한 혈액 응고를 두고. 플라즈마를 수집 하려면 추가 EDTA 또는 구 연산 2 mL 튜브에 혈액 샘플을 추가 하기 전에.</li>
		<li>얼음에 튜브를 저장, 4 ° C에서 10 분 동안 2500 x g에서 원심 및 사용까지 80 ° C에서 혈 청/플라즈마를 저장. 
		참고: 자료에 자료의 테이블에에서 제공 됩니다</li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li><li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children.">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li><li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation.">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li><li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro.">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li><li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation:+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood.">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li><li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation.">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li><li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx:+composition,+functions,+and+visualization.">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li><li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces.">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li><li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium:+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions.">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li><li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles.">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li><li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs.">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 모델은 응고에 대 한 적합 한 응고 및 적와의 상호 작용의 다양 한 측면의 분석을 허용 하는 연구 관련 8 xenotransplantation 연구에서는 인간의 피 9부 화 후 다른 유전자 변형된 돼지 ECs의 항 응 혈 약 속성을 테스트 하는 유용한 시스템입니다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 실험을 시작 하기 전에 microbeads의 전체 셀 범위 (conflu...

단층 선 루멘 혈관의 내 피 세포 (EC)의 혈관 내 피에 의하여 이루어져 있다. 생리 적인 상태에서 무부하 EC는 응고 제와 항 염증 제 환경의 유지 보수에 대 한 책임이 있습니다. 1 이 응고 제와 항 염증 단백질 EC 표면에 표현에 의해 중재 됩니다. 예를 들어 EC 활성화 국 소 빈 혈 또는 reperfusion로 인 한 부상 또는 혈관 거부 (이종-) 이식의 내 피는 응고 제와 항 염증 상태에서 프로 응집과 프로-염증 성 변화에 장기 결과 상태입니다. 1
매혹적이 고 복잡 한 상호작용으로 모방 하는 체 외에서 모델 endothelium 및 응고 요인 연구 가능한 vivo에서 상황 매우 바람직한 있습니다. 기존의 시험관에 응고 분석 실험을 짓는 일반적인 제한 anticoagulated 혈액 응고 중재 효과의 분석 힘든 게의 사용 이며 심지어 recalcification citrated 전체 혈액의 복제 수 없습니다. 신선한 비 anticoagulated 혈액으로 얻을 수 있는 결과. 2 사실, 전통적인 침대 형 세포 배양 시스템에서 그것은 혈액 볼륨 당 충분 한 내 피 세포 표면에 도달 하실 수 없습니다 endothelium의 항 응 혈 약 속성을 이용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 모델 구형 microcarrier 구슬의 표면에 EC를 경작 하 여 이러한 한계를 극복 있도록 EC 표면 혈액 비율의 &#62; 작은 arterioles 또는 정 맥, 상황에 비슷한 16 cm2/mL 도달 될 수 있다 고 EC 표면에 의해 혈액의 "자연" anticoagulation 수 있도록 충분 한 것 설명 했다. 3 , 4 전체 혈액이이 설정에서 추가 응고 없이 사용할 수 있습니다. 혈액 샘플을 실험 하 고 cytokines, 응고 요인 동안 수집 될 수 있습니다 고 수용 성 보수 활성화 마커를 감지 및 측정할 수 있습니다. 또한, EC 코팅 microcarrier 구슬 EC 활성화 마커의 식으로 보완 및 면역 증 착 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 수 있습니다. 또 다른 흥미로운 응용 프로그램 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물의 테스트 포함 되어 있습니다. 5 이 모델을 완전히 동물 실험 대체 수 없습니다, 비록 특정 기능 가설 비보 전 셀을 사용 하 여 테스트 하 고 따라서 국 소 빈 혈 또는 reperfusion에 기초 연구에 사용 된 동물의 수를 줄일 수 있는 방법을 제공합니다 부상 또는 (xeno) 이식.
설명된 모델 모방 xenotransplantation 돼지 대동맥 내 피 셀 (PAEC) microcarrier 구슬에 성장 하 고 전체, 비 anticoagulated 인간의 피와 알을 품는 사용 되었다. 보완 시스템 thrombomodulin 응고 시스템의 규정 (hTBM)의 규칙을 위한 CD46 등 여러 가지 인간 유전자를 운반 하는 다른 유전자 변형 PAEC 그들의 항 응 혈 약 속성에 대 한 분석 했다. 내 피 세포 활성화, 보수, 및 응고 시스템 긴밀 하 게 제어 하 고 상호 연결. 따라서 다른 유전자 변형 세포 접착 분자 식 및 cytokine 릴리스, 인간의 혈액에 노출 된 후 동작 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 6 은 항 응 혈 약 단백질의 손실과 glycocalyx 흘리기. 7

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PAEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from pig aorta in our Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcarrier beads (Biosilon)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Bovine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10644-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1726.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T406-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer flasks</td>
			<td>Tecnomara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological stirrer</td>
			<td>Brouwer</td>
			<td>MCS-104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti CD31</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB33871</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-166-003</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6458</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti vWF</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dk anti Gt IgG &#8211; Alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit - FITC</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-25MG-F</td>
			<td>Dilution 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Concentration: 10% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td>Size: 0.8x19 mm (21&#610; 3/4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>14.1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Available for free at: https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td>2mL in 500mL of DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinun natricum</td>
			<td>Drossa Pharm AG</td>
			<td></td>
			<td>Stock concentration: 5000 U.I./ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamberslides</td>
			<td>Bioswisstec AG</td>
			<td>30108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x6 H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.5833.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>C0563</td>
			<td></td>
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assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood

Vivo에서, 내 피 세포는 혈액 순환의 자연 anticoagulation에 대 한 중요 한. 따라서, 내 피 세포 활성화 혈액 응고에 지도 한다. 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해에서 뿐만 아니라 장기 이식 xenotransplantation를 포함 하 여 미리 형성 된 안티 기증자 항 체의 존재 처럼 많은 임상 상황에서이 현상이 관찰 됩니다. 3R 표준 (감소, 교체 및 수정), 생체 외에서 모델 내 피 세포의 효과 연구에 따르면 동물 실험을 감소 시키기 위하여 활성화 혈액 응고에 매우 바람직한 것 이다. 그러나, 내 피 세포 배양의 일반적인 평판 시스템은 자연, 내 피-중재 anticoagulation에 대 한 충분 한 혈액의 mL 당 피 내 막의 1-5 c m2 의 표면-볼륨 비율을 제공 합니다. Microcarrier 구슬에 내 피 세포를 배양 하는 것은 표면 볼륨 비율 40-160 cm2/mL을 증가할 수 있습니다. 이 증가 비율은 전체 혈액의 "자연" anticoagulation 되도록 충분 한 응고의 사용을 피할 수 있도록 합니다. 여기는 생체 외에서 microcarrier 기반 시스템 전체를 비 anticoagulated 인간의 혈액의 응고에 돼지 내 피 세포의 유전자 조작의 효과 공부 설명 되어 있습니다. 기술된 분석 결과, 기본 돼지 대동맥 내 피 세포, 중 야생 종류 (WT)에서 또는 유전자 변형 인간 CD46 thrombomodulin, 했다 microcarrier 구슬에 성장 그리고 다음 갓 그려진된 비 anticoagulated 인간의 혈액에 노출. 이 모델은 측정 및 활성화로 사이토카인 방출의 정량화에 대 한 보완 및 혈액 플라스마에 응고의 마커 수 있습니다. 또한, 활성화 된 내 피 세포와 면역 글로불린의 증 착의 이미징, 보완 및 응고 단백질 endothelialized 구슬에 confocal 현미경 검사 법에 의해 수행 되었습니다. 이 분석 결과 또한 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물 테스트를 사용할 수 있습니다. 그런 수사에 사용 되는 동물의 수를 줄이기 위해 그것의 잠재력, 위에 설명 된 분석 결과 수행 하기 쉽고 일관 되 게 재현할 수입니다.

스피너 플라스 크 (그림 1)에서 문화 7-10 일 후 셀 confluent microcarrier 구슬 (그림 2)의 전체 표면을 커버 했다. Confluency 상태 확인은 중요 한 단계는 microbeads에 EC의 비 합칠 단층 응고 시간 표시 감소로 이어질 것입니다 때문에, microcarrier는 주어진 구슬의 표면 강하게 직업 응고 (응고 시간: 4 ± 1 분) ( 그림 3).</p...

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Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K 조회수.  University of Bern. 우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

비디오: Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

전체 혈액 자극 분석을 사용하여 프로 염증성 시토킨 IL - 1β의 정확하고 간단한 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

연구

의학

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the low-molecular-weight-heparin (LMWH), enoxaparin. There are also urgent clinical situations where it would be important if this could be determined rapidly. The present assay is designed to accomplish this. We only assayed human blood samples that were spiked with known concentrations of enoxaparin. The essential feature of the present assay is the quantification of the efficacy of enoxaparin in a patient's blood sample by degrading it to complete inactivity with heparinase. Two blood samples were drawn into Vacutainer tubes (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) that were spiked with enoxaparin; one sample was digested with heparinase for 5 min at 37 &deg;C, the other sample represented the patient's baseline anticoagulated status. The percent shortening of clotting time in the heparinase-treated sample, as compared to the baseline state, yielded the anticoagulant contribution of enoxaparin. We used the portable, battery operated Hemochron 801 apparatus for measurements of clotting times (International Technidyne Corp., Edison, NJ). The apparatus has 2 thermostatically controlled (37 &deg;C) assay tube wells. We conducted the assays in two types of assay cartridges that are available from the manufacturer of the instrument. One cartridge was modified to increase its sensitivity. We removed the kaolin from the FTK-ACT cartridge by extensive rinsing with distilled water, leaving only the glass surface of the tube, and perhaps the detection magnet, as activators. We called this our minimally activated assay (MAA). The use of a minimally activated assay has been studied by us and others. 2-4 The second cartridge that was studied was an activated partial thromboplastin time (aPTT) assay (A104). This was used as supplied from the manufacturer. The thermostated wells of the instrument were used for both the heparinase digestion and coagulation assays. The assay can be completed within 10 min. The MAA assay showed robust changes in clotting time after heparinase digestion of enoxaparin over a typical clinical concentration range. At 0.2 anti-Xa I.U. of enoxaparin per ml of blood sample, heparinase digestion caused an average decrease of 9.8% (20.4 sec) in clotting time; at 1.0 I.U. per ml of enoxaparin there was a 41.4% decrease (148.8 sec). This report only presents the experimental application of the assay; its value in a clinical setting must still be established.

Demonstration of a rapid quantitative assay of the inhibition of blood coagulation by the low-molecular-weight-heparin, enoxaparin. The contribution of enoxaparin is assessed by removing its influence through digestion with heparinase. A fuller description of the assay is detailed in our published paper.1 The assay still requires clinical confirmation.

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of cardiovascular disease. Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. Percent capillary recruitment is assessed by dividing the increase in capillary density induced by postocclusive reactive hyperemia (postocclusive reactive hyperemia capillary density minus baseline capillary density), by the maximal capillary density (observed during passive venous occlusion). Percent perfused capillaries represents the proportion of all capillaries present that are perfused (functionally active), and is calculated by dividing postocclusive reactive hyperemia capillary density by the maximal capillary density. Both percent capillary recruitment and percent perfused capillaries reflect the number of functional capillaries. The forearm blood flow (FBF) technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function: The ratio FBFmax/FBFbase is computed as an estimate of vasodilation, by dividing the mean of the four FBFmax values by the mean of the four FBFbase values. Forearm vascular resistance at maximal vasodilation (FVRmax) is calculated as the mean arterial pressure (MAP) divided by FBFmax. Both the capillaroscopy and forearm techniques are readily acceptable to patients and can be learned quickly.
The microvascular and endothelial function measures obtained using the methodologies described in this paper may have future utility in clinical patient cardiovascular risk-reduction strategies. As we have published reports demonstrating that microvascular and endothelial dysfunction are found in initial stages of hypertension including prehypertension, microvascular and endothelial function measures may eventually aid in early identification, risk-stratification and prevention of end-stage vascular pathology, with its potentially fatal consequences.

Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. The forearm blood flow technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function.

Microvascular 및 내피 기능의 비 침습적 평가

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Ultrasound Assessment of Endothelial Function: A Technical Guideline of the Flow-mediated Dilation Test

Cardiovascular disease is the primary cause of mortality and a major cause of disability worldwide. The dysfunction of the vascular endothelium is a pathological condition characterized mainly by a disruption in the balance between vasodilator and vasoconstrictor substances and is proposed to play an important role in the development of atherosclerotic cardiovascular disease. Therefore, a precise evaluation of endothelial function in humans represents an important tool that could help better understand the etiology of multiple cardio-centric pathologies.
Over the past twenty-five years, many methodological approaches have been developed to provide an assessment of endothelial function in humans. Introduced in 1989, the FMD test incorporates a forearm occlusion and subsequent reactive hyperemia that promotes nitric oxide production and vasodilation of the brachial artery. The FMD test is now the most widely utilized, non-invasive, ultrasonic assessment of endothelial function in humans and has been associated with future cardiovascular events.
Although the FMD test could have clinical utility, it is a physiological assessment that has inherited several confounding factors that need to be considered. This article describes a standardized protocol for determining FMD including the recommended methodology to help minimize the physiological and technical issues and improve the precision and reproducibility of the assessment.

The flow mediated dilation (FMD) test is the most commonly utilized, non-invasive, ultrasound assessment of endothelial function in humans. Although the FMD test has been related with the prediction of future cardiovascular disease and events, it is a physiological assessment with many inherent confounding factors that need to be considered.

내피 기능의 초음파 평가 : 흐름 중재 팽창 시험의 기술 가이드 라인

Cardiovascular disease is the primary cause of mortality and a major cause of disability worldwide. The dysfunction of the vascular endothelium is a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...