방법론적 논의를 해주신 최 및 정 연구실 모든 분들께 감사드립니다. 조언과 피드백을 주신 C. Jang과 D. Guertin에게 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어주신 M.S. Choi에게 감사드립니다. 이 작업은 NRF-2022R1C1C1012034에서 SMJ에 자금을 지원했습니다. NRF-2022R1C1C1007023에서 DWC로; NRF-2022R1A4A3024551 - S.M.J. 및 DWC 이 연구는 충남대학교의 지원을 받아 진행되었으며, 그림 1과 그림 2는 BioRender(http://biorender.com/)를 이용하여 제작되었다.

모든 실험은 성균관대학교 동물보호이용위원회(IACUC)의 승인을 받아 진행되었다. 마우스는 매일 12시간의 빛/어둠 주기에 따라 22°C 및 45% 습도로 설정된 클린룸에 위치한 IACUC 승인 동물 시설에 수용되었습니다. 그들은 환기가 잘 되는 선반에 보관되었고 표준 차우 다이어트 광고(탄수화물 60%, 단백질 16%, 지방 3%로 구성)를 이용할 수 있었습니다. 침구와 둥지 재료는 매주 교체되었습니다. 이 연구를 위해 12주 된 25g에서 30g 사이의 체중이 나가는 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 이 동물들은 상업 공급 업체로부터 공급되었습니다 ( 재료 표 참조).
1. 온도 순응과 약리학적인 자극을 통한 갈색 지방이 많은 조직의 변화 활동의 조절
참고: 며칠에서 몇 주에 걸친 온도 적응 또는 β-아드레날린 수용체 작용제를 사용한 약리학적 자극은 BAT 활성을 조절하기 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다1. 따라서 독자가 필요에 따라 적절한 접근 방식을 선택할 수 있도록 방법에 대한 간략한 개요가 아래에 제공됩니다. 대사적으로 비활성(열발생이 적은) BAT를 얻기 위해 C57BL/6J 마우스에 대해 열중성(28-30°C)이라고 하는 기준선 온열 온도를 선택합니다. 이 범위는 쥐가 일정한 체온을 유지하기 위해 추가 에너지를 소비할 필요가 없도록 합니다. 대사적으로 적당히 또는 고활성(열발생) BAT를 얻기 위해 각각 온화한 추위(20-22°C) 또는 심한 추위(6°C) 온도를 선택할 수 있습니다. 이 실험의 목적을 위해, 마우스는 22°C의 표준 사육 조건에서 사육되었으며, 이는 마우스의 경우 약간 차갑지만 약리학적 자극을 수반하지 않았습니다.
<ol><li>온도 적응<ol><li>온도 적응을 시작하기 최소 1주일 전에 케이지당 1마리 또는 2마리의 마우스를 수용하도록 마우스를 분리합니다. 환기, 온도 및 습도 조절 기능을 갖춘 설치류 인큐베이터를 원하는 조건으로 준비합니다.</li>
		<li>선택한 유형의 온도 적응에 적합한 날에 케이지를 각각의 설치류 인큐베이터로 옮깁니다.</li>
		<li>생쥐 수의 분포가 케이지 당 1 개 또는 2 개의 생쥐로 모든 그룹에 균등하게 분포되어 있는지 확인하십시오. 단일 하우징은 그룹 하우징(43)에 비해 온도에 의해 유도된 생리적 변화에 더 민감하기 때문에 선호된다. 각 그룹의 구체적인 주거 조건은 다음과 같습니다.<ol><li>열 중성(30°C) 그룹: 이 그룹의 마우스를 최대 4주 동안 30°C의 온도에서 지속적으로 유지합니다.</li>
			<li>심한 추위 그룹: 처음에는 둥지 재료 없이 이 그룹의 쥐를 18°C에서 수용합니다. 매주 기온이 점진적으로 낮아져 넷째 주에는 6°C에 도달합니다. 온도 진행은 18°C → 14°C → 10°C → 6°C입니다.</li>
			<li>온화한 추위 그룹(20-22°C): 이 그룹의 쥐를 앞서 언급한 표준 하우징 조건과 동일한 조건에서 설치류 인큐베이터에 수용합니다.</li>
			<li>급성 한랭 챌린지: 급성 한랭 챌린지의 경우, 둥지 재료 없이 케이지당 1-2마리의 쥐를 배치하고 6°C로 설정된 설치류 인큐베이터에 최대 8시간 동안 노출시킵니다. 참고: 이러한 하우징 조건과 온도 변화는 다양한 온도 환경이 BAT 활성 및 신진대사에 미치는 영향을 연구하는 데 필수적입니다.</li>
		</ol></li>
		<li>매주 케이지를 교체하고 음식과 물을 보충하십시오. 보충하기 최소 24시간 전에 각각의 온도(설치류 인큐베이터)에서 케이지를 사전 적응시킵니다. 알림: 적절한 온도 자극의 방해를 방지하려면 둥지 구축으로 이어질 수 있는 마우스 농축제를 제공하지 않는 것이 중요합니다. 혹독한 추위에 반응하여 쥐는 체온을 유지하기 위해 더 많은 에너지를 소비하므로 음식 섭취가 증가하고 배설률이 높아집니다. 따라서 일주일에 최소 2-3번(현지 기관 지침에 따라) 케이지를 점검하여 쥐가 음식과 물을 충분히 공급받고 있는지, 케이지가 과도하게 젖지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 모니터링은 연구 기간 동안 쥐의 웰빙과 건강을 유지하는 데 필수적입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>β3-아드레날린 수용체 작용제 CL316,243을 이용한 약리자극1<ol><li>자극 효과를 극대화하려면 주입 전 2-4주 동안 열중성(30°C)에서 마우스를 미리 보관합니다.</li>
		<li>적응 기간 후 복강내 주사 1mg/kg CL316,243. 참고: β3-아드레날린 수용체 작용제를 사용한 만성 자극(예: 3일에서최대 1,44,45주까지)의 경우 약물 안정성으로 인해 매일 주사해야 합니다. 희석된 CL316,243은 안정성을 위해 주사 당일에 준비해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 동정맥혈 채취
참고: 12-14주 이상의 마우스는 동정맥혈 샘플링에 가장 권장됩니다. 어린 마우스는 견갑간 BAT46에서 정맥혈을 특이적으로 배출하는 뚜렷한 혈관인 슐처 정맥(Sulzer's veins)의 크기가 충분하지 않을 수 있습니다.
<ol><li>유도를 위해 3% 이소플루란(205 x 265 x 200mm 크기 챔버에서) 및 유지 관리를 위해 2% 이소플루란(가스 마취 마스크 사용)으로 보정된 기화기를 사용하여 부드럽게 마취합니다. 알림: 전체 동정맥혈 채취 절차는 마취 후 즉시 수행해야 합니다. 심부 체온을 유지하기 위해 마취 중에 물 가열 온열 패드를 사용할 수 있습니다. 주의 : 이소플루란은 흡입 시 휘발성이 높고 독성이 있습니다. 따라서 1차 마취는 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>마취가 적절한 깊이에 도달했는지 확인하기 위해 발 후퇴와 같은 동물의 반사 신경을 확인합니다.</li>
	<li>슐처의 정맥에서 정맥혈 채취<ol><li>마우스를 배치하여 등쪽 피부가 노출되도록 하고 절개 직전에 발가락 꼬집을 통해 마취 깊이를 확인합니다. 등쪽 피부에 70% 에탄올을 충분히 적셔 털이 빠지지 않도록 하고 흉부 아래쪽에서 목까지 등을 절개합니다. 참고: 견갑골 간 BAT는 피부 바로 아래에 있으며 얇은 흰색 지방 조직으로 덮인 두 개의 지방 패드로 구성되어 있습니다. 가스 마취 마스크를 통해 마우스가 마취 상태를 유지하는지 확인하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>구부러진 끝 겸자로 견갑간 BAT를 부드럽게 들어 올리고 대부분 근육인 부착된 조직을 조심스럽게 자릅니다. 지방 패드를 머리 쪽으로 들어 올리고 부착된 조직을 계속 자르고 설처 정맥(견갑간 BAT의 양쪽 지방 패드에 연결된 큰 'Y'자 모양의 짙은 빨간색 혈관)이 노출될 때까지 해당 부위를 조심스럽게 엽니다. 참고: 견갑간 BAT의 전방 및 측면 부위와 연결된 근육 조직의 모세혈관을 절단하지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>Sulzer의 정맥을 조심스럽게 자르고 바닥을 자른 200μL 피펫 팁과 P100 피펫을 사용하여 약 40μL의 혈액을 수집합니다. 혈액을 채혈 튜브에 보관하고 혈청 채혈 과정이 진행될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 참고: Sulzer 정맥의 Y자형 분단점 바로 아래에서 혈액을 채취하여 상대정맥47에서 혈액 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 혈액을 너무 많이 모으면 슐처 정맥의 특성이 약해집니다. 따라서 분석을 위해 Sulzer의 정맥에서 필요한 최소한의 혈액을 수집해야 합니다. 혈청과 혈장이 서로 다른 대사 산물 프로파일 48,49,50을 생성하므로 채혈 튜브를 선택할 때 신중해야 합니다. 혈장 채취를 위해서는 헤파린 코팅 튜브를 사용해야 합니다. 이 실험에서는 혈청을 얻기 위해 응고 활성제 코팅 튜브를 선택했습니다. EDTA는 질량 분석 신호51,52에 큰 영향을 미치므로 어떠한 경우에도 EDTA 코팅 튜브를 사용해서는 안 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>좌심실에서 동맥혈 채취<ol><li>콧방울과의 접촉을 잃지 않고 마우스를 뒤집어 복부 피부를 노출시킵니다. 절개하기 전에 발가락 꼬집기를 통해 마취 깊이를 확인합니다. 복부 피부에 70%의 에탄올을 충분히 적셔 모발이 빠지지 않도록 하고, 흉강을 가위로 조심스럽게 열어 내부 구조를 손상시키지 않고 심장을 노출시킵니다.</li>
		<li>29G(1/2") 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여 좌심실의 정점 부위를 정확하게 찔렀습니다. 1/2'' 바늘의 2/3를 심장 정점의 오른쪽 수평으로 3-5mm까지 삽입하고(그림 1B) 주사기를 뒤로 당겨 좌심실(50-100μL)에서 혈액을 수집합니다. 좌심실에서 나오는 혈액은 산소가 공급된 동맥혈로 선홍색입니다. 혈액을 채혈 튜브에 보관하고 혈청 채혈 과정이 진행될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 알림: 심장에 접근하기 위해 흉강을 최소한으로 절개해야 합니다. 과도하게 절개하면 국소 출혈이 발생하여 저혈압이 발생할 수 있습니다. 이는 좌심실에서 채취한 동맥혈의 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 심장을 회전시키거나 뒤집으면 좌심실의 정확한 위치를 파악하기 어려울 수 있으므로 피하십시오.</li>
		<li>안락사를 수행하고 지역 기관의 지침에 따라 적절한 방법으로 안락사를 보장합니다. 예를 들어, 안락사는 자궁 경부 탈구를 통해 수행 될 수 있으며 심장 박동의 정지로 확인 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>혈액 샘플을 10,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 상층액에는 사용되는 혈액 수집 튜브의 유형에 따라 혈청 또는 혈장이 포함되어야 합니다. 여기서 멈추고 GC-MS 분석을 위한 혈청 처리까지 -20°C에서 샘플을 보관할 수 있습니다. 알림: 붉은 색의 상층액이 관찰되면 용혈이 잠재적으로 발생할 수 있습니다. 용혈을 방지하려면 응고가 완료되기 전에 샘플을 소용돌이치십시오. 글루타민과 젖산을 포함한 일부 적혈구가 풍부한 대사 산물은 데이터 해석을 잘못 초래할 수 있지만 대부분의 대사 산물은 용혈의 영향을 크게 받지 않을 수 있습니다. 일주일 이내에 혈청/혈장을 분석하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 혈청과 화학 유도체화에서 대사 산물 적출
<ol><li>추출 준비 참고: 대사산물 추출, 유도체화 및 데이터 분석을 포함한 모든 방법은 이전에 설명된 방법53,54의 약간 수정된 버전입니다.<ol><li>내부 표준물질인 DL-노르발린 100μM 용액( 재료 표 참조)을 MS 등급 메탄올에 첨가하여 추출 완충액을 준비합니다.</li>
		<li>모든 실험 절차가 얼음 위에서 수행되는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>Sulzer의 정맥 또는 좌심실에서 추출한 10μL의 마우스 혈청을 40μL의 추출 완충액이 들어 있는 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>세포 파편과 단백질을 제거하기 위해 혈청 샘플을 잠시 소용돌이친 다음 4°C에서 30분 동안 최대 속도(18,000 x g)로 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리 후 40μL의 상층액을 유리 바이알에 조심스럽게 옮긴 다음 4°C의 진공 원심분리기에서 3시간 동안 건조합니다. 참고: 후속 유도체화 단계 전반에 걸쳐 사용되는 플라스틱 반응성 화학 물질로 인해 플라스틱 튜브 대신 유리 삽입물( 재료 표 참조)을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>혈청 대사 산물의 GC-MS 분석을 위해 건조된 샘플에 두 개의 연속 유도체화 단계를 적용합니다. 알림: 다음 단계는 용매의 자극 위험으로 인해 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다.<ol><li>피리딘에 용해된 10mg/mL 메톡시아민 염산염( 재료 표 참조) 30μL에 건조된 혈청 추출물을 재현탁시키고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>70°C에서 1시간 동안 70μL의 N-메틸-N-tert-부틸디메틸실리플루오로아세트아미드(MTBSTFA, 재료 표 참조)로 대사 산물의 실릴화를 위한 샘플을 유도체화합니다. 알림: 플라스틱과 반응하는 유도체화 용매로 인해 다음 단계에서 플라스틱 팁 대신 유리 주사기를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. GC-MS를 이용한 대사체학 분석
참고: 단일 4중 GC-MS( 재료 표 참조)를 사용하여 Sulzer 정맥 및 좌심실의 유도체화된 샘플에서 탄수화물, 아미노산 및 TCA 회로 중간체를 포함한 다양한 혈청 대사 산물을 측정했습니다. 다른 컬럼을 대안으로 사용할 수 있지만, 온도 프로그램을 포함한 실험 설정은 사용되는 컬럼의 유형에 따라 달라질 수 있습니다.
<ol><li>헬륨을 1.500mL/min(설정점)의 운반 가스로 사용하여 280°C(입구 온도)에서 비분할 모드로 유도체화된 시료 1μL를 GC에 주입합니다.</li>
	<li>사중극자를 200°C로 설정하고 GC-MS 인터페이스를 300°C로 설정합니다. 알림: 모든 대사 산물 분석을 위한 오븐 프로그램은 60°C에서 시작하여 1분 동안 유지된 다음 온도가 10°C에 도달할 때까지 320°C/분의 속도로 증가합니다.</li>
	<li>70eV로 설정된 전자 이온화(EI)로 데이터를 수집하고 스캔 모드(50-550m/z)53에서 샘플 데이터를 수집합니다. 이 연구에 사용된 모든 대사 산물은 이전에 질량 스펙트럼 및 머무름 시간을 확인하기 위한 표준으로 검증되었습니다.</li>
	<li>시중에서 판매되는 분석 소프트웨어를 사용하여 피크 면적 적분을 수행합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>화합물을 각 TBMDS 유도체의 생성물 이온과 일치시킵니다. 그런 다음 해당 피크 영역에 단편 이온의 m/z 값을 적분하여 추출 이온 크로마토그램(EIC)을 얻은 다음 내보냅니다. 단편 이온은 표 1에 나타내었다. 참고: 각 화합물의 EIC는 각 샘플에서 DL-노르발린의 EIC로 정규화되었습니다. 데이터는 정규화된 각 EIC 값을 사용하여 좌심실에 대한 로그2 슐처 정맥(Log2(SV/LV))으로 표시됩니다.</li>
</ol>

갈색 지방 조직에서의 대사산물 교환 탐구

저자는 보고할 이해 상충이 없음을 선언합니다.

전신 에너지 균형에서 BAT의 대사 잠재력을 이해하는 데 중요한 단계는 BAT가 소비하는 영양소, 대사 처리 방법, 순환계로 방출되는 대사 산물을 정의하는 것입니다. 이 프로토콜은 C57BL/6J 마우스에서 견갑간 BAT의 정맥 혈관 및 전신 동맥 혈관에 접근할 수 있는 특수 동정맥 샘플링 기술을 도입하며, 이는 최근 Park etal 42에 의해 개발 및 검증되었습니다. 다음은 프로토콜을 따를 때 ?...

갈색 지방 조직(BAT)은 미토콘드리아 분리 단백질 1(UCP1) 의존성 및 UCP1 독립적 메커니즘 1,2,3,4,5를 모두 포함하는 비떨림 열발생(NST)으로 알려진 고유한 에너지 소비 특성을 가지고 있습니다. 이러한 특징은 BAT가 전신 대사 조절과 비만, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환 및 암 악액질을 포함한 대사 질환의 발병기전을 암시합니다 6,7,8. 최근의 후향적 연구는 BAT 질량 및/또는 그 대사 활동과 인간의 비만, 고혈당증 및 심장 대사 건강 사이의 반비례 관계를 보여주었습니다 9,10,11.
최근 BAT는 발열 연료로서 상당한 양의 순환 영양소를 필요로 하기 때문에 NST를 유지하는 대사 싱크로 제안되었습니다 6,7. 또한, BAT는 내분비 및/또는 부분비 신호로 작용하는 갈색 아디포카인 또는 BATokine이라고 하는 생체 활성 인자를 생성 및 방출할 수 있으며, 이는 시스템 수준의 대사 항상성에 적극적으로 관여함을 나타냅니다 12,13,14,15. 따라서 BAT의 영양 대사를 이해하면 체온 조절 기관으로서의 전통적인 역할을 넘어 인간에 대한 병태생리학적 중요성에 대한 이해가 향상될 것입니다.
비대사성 방사성 추적자를 사용하는 고전적인 영양소 흡수 연구와 안정 동위원소 추적자를 사용하는 대사체 연구는 BAT가 우선적으로 어떤 영양소를 흡수하고 어떻게 활용하는지에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 예를 들어, 방사성 추적자 연구는 저온 활성 BAT가 포도당, 지단백질 결합 지방산 및 분지 사슬 아미노산 16,17,18,19,20,21,22,23,27을 흡수한다는 것을 입증했습니다. 대사체 연구와 결합된 최근의 동위원소 추적을 통해 조직 및 배양 세포 내에서 이러한 영양소의 대사 운명과 흐름을 측정할 수 있게 되었습니다 24,25,26,28,29,30. 그러나 이러한 분석은 주로 영양소의 개별 활용에 초점을 맞추기 때문에 장기 대사 산물 교환에서 BAT의 시스템 수준 역할에 대한 지식은 제한적입니다. BAT가 소비하는 특정 순환 영양소와 탄소 및 질소 측면에서 양적 기여도에 대한 질문은 여전히 파악하기 어렵습니다. 또한, BAT가 영양소를 사용하여 대사 산물 유래 BATokine(예: 리포카인)을 생성 및 방출할 수 있는지에 대한 탐구는 이제 막 시작되었습니다 12,13,14,15,31,32.
동정맥혈 분석은 장기/조직에서 순환 분자의 특정 흡수 또는 방출을 평가하는 데 사용되는 고전적인 생리학적 접근 방식입니다. 이 기술은 이전에 산소와 여러 대사 산물을 측정하기 위해 쥐의 견갑골 간 BAT에 적용되어 BAT를 이화 전위 33,34,35,36,37을 가진 적응 열 발생의 주요 부위로 설정했습니다. 최근 쥐의 견갑간 BAT를 사용한 동정맥 연구는 트랜스오믹스 접근법과 결합되어 열발생 자극 BAT38에 의해 방출되는 발견되지 않은 BATokine을 식별했습니다.
최근 고감도 가스 크로마토그래피 및 액체 크로마토그래피 질량분석법(GC-MS 및 LC-MS) 기반 대사체학의 발전으로 장기 특이적 대사산물 교환의 정량 분석을 위한 동정맥 연구에 대한 관심이 다시 높아졌습니다 39,40,41. 이러한 기술은 높은 분해능과 질량 정확도를 통해 소량의 시료를 사용하여 광범위한 대사 산물을 포괄적으로 분석할 수 있습니다.
이러한 발전에 발맞추어, 최근의 한 연구는 쥐 수준에서 BAT를 연구하기 위해 동정맥 대사체학을 성공적으로 채택하여, 다양한 조건 하에서 BAT의 대사체 교환 활성에 대한 정량적 분석을 가능하게 했다42. 이 기사에서는 C57BL/6J 마우스 모델에서 GC-MS를 사용하는 BAT 표적 동정맥 대사체학 프로토콜을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L Filter Tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX.TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7077B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7693A Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4513A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 8890 GC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent J&#38;W GC column (Capilary column) HP-5MS UI</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433UI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3335-90240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>DBL</td>
			<td>C57BL/6JBomTac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap -50 &#176;C Cold Trap (with Stainless steel Lid)</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7811041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Norvaline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7502-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass insert 250 &#956;L&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Q34966-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>226904-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette&#160;200 Serum, 200 &#181;L, cap red, flat base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1290.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBSTFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>394882-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine(anhydrous, 99.8%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270970-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7310041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent diet</td>
			<td>SAFE</td>
			<td>SAFE R+40-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent incubator</td>
			<td>Power scientific</td>
			<td>RIT33SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>328203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Cap 9 mm</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

arteriovenous metabolomics to measure in vivo metabolite exchange in brown adipose tissue

갈색 지방 조직(BAT)은 비떨림 열발생으로 알려진 독특한 에너지 소비 과정을 통해 대사 항상성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이를 위해 BAT는 높은 신진대사 수요를 지원하기 위해 다양한 순환 영양소 메뉴를 활용합니다. 또한 BAT는 대사 연료 또는 신호 분자 역할을 할 수 있는 대사 산물 유래 생체 활성 인자를 분비하여 BAT에 의해 매개 조직 내 및/또는 조직 간 통신을 촉진합니다. 이는 BAT가 전신 대사 산물 교환에 적극적으로 참여한다는 것을 시사하며, 이는 이제 연구되기 시작한 흥미로운 특징입니다. 여기에서는 생체 내 마우스 수준에 최적화된 BAT 동정맥 대사체학을 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜은 견갑간 BAT 유래 정맥혈과 전신 동맥혈을 선택적으로 배출하는 Sulzer 정맥을 사용하는 동정맥 혈액 샘플링 기술과 열발생 자극을 위한 관련 방법에 중점을 둡니다. 다음으로, 이러한 혈액 샘플을 사용하는 가스 크로마토그래피 기반 대사체학 프로토콜을 시연합니다. 이 기법을 사용하면 BAT에 의한 대사 산물의 순 흡수 및 방출을 측정하여 장기 간 수준에서 BAT 조절 대사 산물 교환에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다.

Brown adipose tissue (BAT) possesses a unique energy expenditure property known as non-shivering thermogenesis (NST), which involves both mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1)-dependent and UCP1-independent mechanisms1,2,3,4,5. These distinctive characteristics implicate BAT in the regulation of systemic metabolism and the pathogenesis of metabolic diseases, including obesity, type 2 diabetes, cardiovascular disease, and cancer cachexia6,7,8. Recent retrospective studies have shown an inverse association between BAT mass and/or its metabolic activity with obesity, hyperglycemia, and cardiometabolic health in humans9,10,11.
Recently, BAT has been proposed as a metabolic sink responsible for maintaining NST, as it requires substantial amounts of circulating nutrients as thermogenic fuel6,7. Furthermore, BAT can generate and release bioactive factors, referred to as brown adipokines or BATokines, which act as endocrine and/or paracrine signals, indicating its active involvement in systems-level metabolic homeostasis12,13,14,15. Therefore, understanding BAT&#39;s nutrient metabolism should enhance our understanding of its pathophysiological significance in humans, beyond its conventional role as a thermoregulatory organ.
Metabolomic studies employing stable isotope tracers, in combination with classic nutrient uptake studies using non-metabolizable radiotracers, have significantly improved our understanding of which nutrients are preferentially taken up by BAT and how they are utilized16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. For instance, radioactive tracer studies have demonstrated that cold-activated BAT takes up glucose, lipoprotein-bound fatty acids, and branched-chain amino acids16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recent isotope tracing combined with metabolomic studies has allowed us to measure the metabolic fate and flux of these nutrients within tissues and cultured cells24,25,26,28,29,30. However, these analyses primarily focus on the individual utilization of nutrients, leaving us with limited knowledge of BAT&#39;s systems-level roles in organ metabolite exchange. Questions regarding the specific series of circulating nutrients consumed by BAT and their quantitative contributions in terms of carbon and nitrogen remain elusive. Additionally, the exploration of whether BAT can generate and release metabolite-derived BATokines (e.g., lipokines) using nutrients is just beginning12,13,14,15,31,32.
Arteriovenous blood analysis is a classic physiological approach used to assess the specific uptake or release of circulating molecules in organs/tissues. This technique has previously been applied to the interscapular BAT of rats to measure oxygen and several metabolites, thereby establishing BAT as the major site of adaptive thermogenesis with its catabolic potential33,34,35,36,37. Recently, an arteriovenous study using rat interscapular BAT was coupled with a trans-omics approach, leading to the identification of undiscovered BATokines released by thermogenically stimulated BAT38.
Recent advances in high-sensitivity gas chromatography- and liquid chromatography-mass spectrometry (GC-MS and LC-MS)-based metabolomics have reignited interest in arteriovenous studies for the quantitative analysis of organ-specific metabolite exchange39,40,41. These techniques, with their high resolving power and mass accuracy, enable the comprehensive analysis of a wide range of metabolites using small sample quantities.
In alignment with these advancements, a recent study successfully adapted arteriovenous metabolomics for studying BAT at the mouse level, enabling the quantitative analysis of metabolite exchange activities in BAT under different conditions42. This article presents a BAT-targeted arteriovenous metabolomics protocol using GC-MS in a C57BL/6J mouse model.

저자 스포트라이트: 지방 조직 대사 및 질병 예방을 위한 새로운 길 조명(Illuminating New Avenues for Adipose Tissue Metabolism and Disease Prevention) 

갈색 지방 조직에서 생체 내 대사산물 교환을 측정하기 위한 동정맥 대사체학

Our lab is interested in identifying mechanisms by which signaling pathways and metabolic pathways collaborate to regulate adipose tissue metabolism and physiology. And through that approach, we aim to find a way to prevent or target metabolic diseases caused by energy imbalances such as obesity and diabetes. The major advantage of our protocol is we have shifted from the conventional rat model to using a mouse model for arterial venous blood sampling and metabolomic analysis.We believe that this transition will allow us to validate our findings using the gold standard genetic models more rapidly for brown fat research.

그림 1 은 BAT에 최적화된 AV 대사체학의 실험 방식을 보여줍니다. 프로토콜 섹션에서 언급한 바와 같이, 차등적으로 자극된 갈색 지방 조직을 얻기 위해 마우스는 설치류 인큐베이터를 사용하여 온도 적응을 거치거나 β-아드레날린성 수용체 작용제와 같은 약리학적 투여를 받습니다. 그 후, 마우스를 마취하고 대사체 분석을 위해 혈액 샘플을 수집합니다(그?...

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이 프로토콜에서는 마우스 모델에서 GC-MS를 사용하는 BAT에 최적화된 동정맥 대사체학과 관련된 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법을 통해 유기체 수준에서 BAT 매개 대사 산물 교환에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

우리 연구실은 신호 전달 경로와 대사 경로가 협력하여 지방 조직 대사 및 생리를 조절하는 메커니즘을 규명하는 데 관심이 있습니다. 그리고 이러한 접근 방식을 통해 비만과 당뇨병과 같은 에너지 불균형으로 인한 대사 질환을 예방하거나 표적으로 삼는 방법을 찾는 것을 목표로 합니다. 우리 프로토콜의 가장 큰 장점은 동맥 정맥혈 샘플링 및 대사체 분석을 위해 기존 쥐 모델에서 마우스 모델을 사용하는 것으로 전환했다는 것입니다.우리는 이러한 전환을 통해 갈색 지방 연구를 위해 금본위제 유전자 모델을 사용하여 우리의 발견을 더 빠르게 검증할 수 있을 것이라고 믿습니다.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

1.0K 조회수.  Sungkyunkwan University (SKKU). 우리 연구실은 신호 전달 경로와 대사 경로가 협력하여 지방 조직 대사 및 생리를 조절하는 메커니즘을 규명하는 데 관심이 있습니다. 그리고 이러한 접근 방식을 통해 비만과 당뇨병과 같은 에너지 불균형으로 인한 대사 질환을 예방하거나 표적으로 삼는 방법을 찾는 것을 목표로 합니다. 우리 프로토콜의 가장 큰 장점은 동맥 정맥혈 샘플링 및 대사체 분석을 위해 기존 쥐 ...

비디오: 저자 스포트라이트: 지방 조직 대사 및 질병 예방을 위한 새로운 길 조명(Illuminating New Avenues for Adipose Tissue Metabolism and Disease Prevention) 

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering thermogenesis. To achieve this, BAT utilizes a diverse menu of circulating nutrients to support its high metabolic demand. Additionally, BAT secretes metabolite-derived bioactive factors that can serve as either metabolic fuels or signaling molecules, facilitating BAT-mediated intratissue and/or intertissue communication. This suggests that BAT actively participates in systemic metabolite exchange, an interesting feature that is beginning to be explored. Here, we introduce a protocol for in vivo mouse-level optimized BAT arteriovenous metabolomics. The protocol focuses on relevant methods for thermogenic stimulations and an arteriovenous blood sampling technique using Sulzer's vein, which selectively drains interscapular BAT-derived venous blood and systemic arterial blood. Next, a gas chromatography-based metabolomics protocol using those blood samples is demonstrated. The use of this technique should expand the understanding of BAT-regulated metabolite exchange at the inter-organ level by measuring the net uptake and release of metabolites by BAT.

In this protocol, methods relevant for BAT-optimized arteriovenous metabolomics using GC-MS in a mouse model are outlined. These methods allow for the acquisition of valuable insights into BAT-mediated metabolite exchange at the organismal level.

연구

생화학

Arteriovenous Blood Sampling Technique in Mice Using Sulzer's Vein and Left Ventricle for Metabolomic Analysis

Arteriovenous Blood Sampling Technique in Mice Using Sulzer&#039;s Vein and Left Ventricle for Metabolomic Analysis  

To begin, position the mouse on a dissection tray equipped with a nose cone for anesthesia delivery. Verify the animal's reflexes, such as paw retraction, to confirm that the anesthesia has reached an appropriate depth. Then, position the mouse to expose the dorsal skin.Dampen the skin with ample 70%ethanol to prevent hair detachment. Make an incision along the back, starting from the lower part of the thorax and extend it up to the neck. Using bent tip forceps, gently lift the interscapular brown adipose tissue and carefully cut the attached tissue.Lift the fat pad toward the head and continue cutting the attached tissues to carefully open the region until the Sulzer's vein is exposed. Now, carefully cut the Sulzer's vein. Using bottom cut 200 microliter pipette tip and a P100 pipette, collect approximately 40 microliters of blood and store the collected blood in a blood collection tube.Keep the tube on ice until the serum collection process. Dampen the ventral skin generously with 70%ethanol to prevent hair detachment. Using scissors, carefully open the thoracic cavity to expose the heart.Using a one milliliter syringe equipped with a 29-gauge half inch needle, precisely puncture the apex area of the left ventricle. Insert two-thirds of the needle approximately three to five millimeters to the right horizontal of the heart apex, and pull the syringe back to collect blood from the left ventricle. Then, centrifuge the blood samples at 10, 000G for 10 minutes at four degrees Celsius.Using a pipette, collect the supernatant and proceed with metabolite extraction and analysis.