NLR 면역 수용체는 다양한 병원체에 대한 식물 방어를 중재하는 데 중요한 역할을합니다. 우리는 니코티아나 벤타미안 식물에 있는 면역 수용체와 같은 NLR를 포함하는 Toll/interleukin-1 수용체 도메인의 상호 작용 파트너의 식별을 위한 TurboID 기지를 둔 근접 라벨링 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 식물 종에서 단백질 단백질 상호 작용을 조사하기위한 중요한 참조를 제공하고 니코티아나 벤타미안에 관심있는 모든 단백질로 확장 될 수있다.
TurboID 기반 근접 라벨링 접근법은 생체 내에서 일시적 또는 약한 단백질 단백질 상호 작용을 포착하는 데 사용할 수 있기 때문에 전통적인 접근 방식에 비해 뚜렷한 이점을 가지고 있습니다. 고밀도에서 젖은 토양에서 N.benthamiana 씨앗을 재배하여 시작합니다. 섭씨 23~25도의 18시간 빛과 8시간 어두운 사진 으로 기후 챔버에서 유지하십시오.
그들은 후속 농가 침투에 대한 4 ~ 8의 잎 단계로 성장할 때까지 약 4 주 동안 챔버에 식물을 유지합니다. TurboID 융합을 구성하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 아그로박테리움 tumefaciens 유능한 세포로 변환합니다. 완전히 성숙한 N.benthamiana 잎의 축축표의 접종에 침투하기 위해 1 밀리리터 바늘없는 주사기를 사용합니다.
여과 후 36시간 동안 200마이크로몰러 비오틴을 잎에 침투하여 잎 조직을 수확하기 전에 3~12시간 동안 식물을 유지합니다. 잎 샘플을 수집하려면, 쁘띠올의 기지에서 침투 잎을 잘라 잎 정맥을 제거하고, 액체 질소에 조직을 동결 플래시. 잎 조직을 유봉과 박격포로 갈아서 15 또는 50 밀리리터 팔콘 튜브에 섭씨 영하 80도에 저장합니다.
총 단백질을 추출하려면 약 0.35 그램의 잎 분말을 2 밀리리터 튜브로 전달하십시오. 이 과정에서 액체 질소의 저온에서 조직을 유지하십시오. 700 마이크로리터의 RIPA 용해 버퍼를 파우더에 넣습니다.
튜브를 10분 동안 소용돌이치며 30분 동안 샘플을 얼음 위에 두고 튜브를 반전시켜 4~5분마다 내용물들을 섞습니다. 10 분 동안 섭씨 4도에서 20, 000 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 수집합니다.
탈염 컬럼을 통해 샘플을 실행하여 무료 비오틴을 제거합니다. 컬럼 하단의 실러를 제거하고 50 밀리리터 튜브에 놓습니다. 그런 다음 캡을 풀고 컬럼을 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 분리합니다.
탈염 컬럼을 신선한 50 밀리리터 튜브에 넣고 RIPA 리시스 버퍼 5밀리리터로 컬럼을 3번 평형화합니다. 원심분리기는 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 2분간, 매번 흐름을 폐기합니다. 1.5 밀리리터의 단백질 추출물을 평형 컬럼의 수지 위에 넣습니다.
그리고 추출물이 수지에 들어가면 RIPA 리시스 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 컬럼을 2분 동안 원심분리하고 탈염된 샘플을 얼음 위에 두어 추가 사용이 가능해질 때까지 그대로 둡니다. 탈염 단백질 추출물을 정량화하려면 바이오 라드 분광계를 사용하여 OD595를 측정합니다.
그라데이션 BSA 용액의 값을 기준으로 표준 곡선을 그리고 탈염 단백질 샘플의 농도를 계산합니다. 실온에서 1분 동안 RIPA 용해 버퍼 1밀리리터로 자성구를 분리합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 구슬을 3분 동안 흡수하고 용액을 부드럽게 흡인시합니다.
그런 다음 세탁을 한 번 더 반복합니다. 단백질 추출물을 평형 마그네틱 구슬로 옮기고 회전기에서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 튜브를 배양하여 단백질을 정화합니다. 다음 날, 마그네틱 랙으로 구슬을 캡처하고 슈퍼 나티브를 흡인.
다음으로, 튜브에 추가하여 1.7 밀리리터의 워시 버퍼로 구슬을 씻고 8 분 동안 로터에 배양하십시오. 앞서 설명한 대로 상체를 제거하고 세척 버퍼 2의 1.7 밀리리터로 세척을 반복하고 버퍼 3을 세척합니다. 세제를 제거하기 위해 50 밀리머 트리 HCL의 1.7 밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 튜브를 자기 랙에 놓고 상체를 제거합니다. 50 밀리머 트리스 HCL의 1 밀리리터로 세척을 반복하고 구슬을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨보십시오. 마지막으로, 50 밀리몰라 중탄산염 버퍼로 구슬을 세척당 5분간 6회 세척합니다.
면역blot 분석을 위해 100 마이크로리터의 비드를 사용하여 생체화 단백질의 농축을 확인하고 나머지 시료를 영하 80도에서 보관할 수 있도록 플래시를 동결합니다. 서양 얼룩은 농약 이내 N.benthamiana 잎에서 단백질 발현 및 생체 자극을 분석하는 데 사용되었다. 침투된 잎에 있는 생물요닉한 단백질은 후속 질량 분광법 분석을 위한 연쇄상비딘 C1 공액 자기 구슬로 효율적으로 농축되었다.
다양한 크기의 다른 단백질이 포착되었고 농축 된 단백질의 서양 얼룩 분석은 얼룩진 밴드를 보였다. 이 절차를 시도할 때는 탈염 열 의 하단에있는 실러를 제거하고 각 원심 분리 전에 캡을 느슨하게해야합니다. 이 프로토콜은 니코티아나 벤타미안에 대한 관심있는 다른 단백질에 쉽게 적응할 수 있으며 다른 식물 종에서 TurboID PL을 확장하는 데 사용할 수도 있습니다.
