연골 조직 공학 및 재생 의학 분야에서는 지속적인 치료를 개선하고 새로운 치료 전략을 개발한다는 측면에서 생물학적 및 기능적 결과를 향상시켜야 하는 요구 사항이 여전히 존재합니다. 현재 전임상 연구는 연골 유래 연골 형성 동물을 연골 치유를 위한 실행 가능한 옵션으로 사용할 수 있는 가능성을 시사합니다. 현재 연구에는 추가 성장 인자 및 유전자 재조합 기술을 사용하여 낮은 비대 효능을 유지하면서 연골 형성 잠재력을 더욱 향상시키는 전략이 포함됩니다.
연골형성인자는 명명법에 대한 합의 부족, 다양한 분리 기술, 특성화의 어려움, 배양 조건의 가변성, 기본 메커니즘에 대한 제한된 이해 등의 실험적 문제에 직면해 있습니다. 연골형성 물질이 일반적으로 사용되는 세포에 비해 긍정적인 결과를 나타낸다는 것을 임상적으로 입증하면 연골 관련 병리와 관련된 전반적인 부담을 크게 줄일 수 있습니다. 전구 세포에서 유래한 세포외 소포체와 같은 cell-free 대안을 사용하고 진정한 hyaline 유사 연골의 재생을 위한 재조합 전략을 사용하여 개선된 치료법의 진화.
먼저 멸균 상태에서 1X PBS에서 인간 기증자로부터 경골 대퇴골 또는 무릎 관절을 채취한 다음 적출된 관절을 후드의 멸균 언더패드로 옮깁니다. 관절을 안정시키려면 연골이 위를 향하도록 연골하골을 잡습니다. 숫자 22 메스 날을 사용하여 체중을 지탱하지 않는 영역에서 직사각형 모양의 연골 부스러기를 채취합니다.
연골을 표층에서 깊은 층까지 8mm x 10mm 크기의 부분으로 자릅니다. PBS로 슬라이스를 씻은 후 1-2밀리리터의 일반 Dulbecco 변형 독수리 배지 또는 DMEM이 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, 숫자 22 메스 날을 사용하여 연골 조각을 1mm 큐브보다 작은 크기로 다집니다.
먼저 발치한 인간의 무릎 관절에서 다진 연골을 채취합니다. 효소 분해를 위해 0.15% 콜라겐분해효소 II형이 함유된 10ml의 무혈청 DMEM/F-12가 들어 있는 직립 T25 플라스크에 다진 연골을 넣습니다. 플라스크를 이산화탄소 인큐베이터에 12-14시간 동안 그대로 두십시오.
하룻밤 동안 소화한 후, 방출된 연골세포를 포함하는 배지를 새로운 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 여과기를 사용하여 파편에서 세포를 분리합니다. 동일한 부피의 DMEM/F-12와 10%의 소 태아 혈청 또는 FBS를 추가합니다.
여과된 세포를 1, 200G에서 섭씨 37도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버린 후 펠릿을 1ml의 배지로 재구성합니다. trypan blue exclusion assay를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.
다음으로, 연골 세포를 10의 농도로 T25 플라스크, 평방 센티미터 당 000 세포에 적재하십시오. 10%FBS를 포함하는 DMEM/F-12를 사용하여 셀을 필요한 통과 수까지 확장합니다. EDTA를 함유한 0.125%트립신을 사용하여 서브컨플루언스에서 세포를 수확하기 전에 3일마다 배지를 새로 고칩니다.
연골세포는 로딩 후 즉시 부착되었으며 확장됨에 따라 둥근 조약돌 모양에서 섬유아세포 모양으로 전환되었습니다. 먼저 추출한 인간 경골 대퇴골 또는 무릎 관절에서 연골 부스러기를 얻습니다. 연골 부스러기를 하룻밤 동안 순차적으로 효소 분해를 실시하되, 먼저 0.2%프로나제를 3시간 동안 사용한 다음, 0.04%콜라겐분해효소 II형을 섭씨 37도로 유지되는 수조에서 12시간 동안 사용합니다.
그런 다음 6웰 플레이트의 필요한 수의 웰에 1.5ml의 PBS 피브로넥틴 용액을 코팅합니다. 접시를 단단히 밀봉하고 섭씨 4도에서 밤새 냉장 보관합니다. 다음 날, 냉장고에서 피브로넥틴으로 코팅된 6웰 플레이트를 꺼냅니다.
과도한 피브로넥틴을 제거한 후 코팅된 웰에 2-3ml의 일반 DMEM/F-12 배지를 추가합니다. 4의 조밀도에 의하여 입힌 well에 풀어 놓인 chondrocytes를 씨를 뿌려서, 우물 당 000의 세포는 20 분 동안 방해받지 않는 남겨둔다. 배양 후 과도한 배지와 비부착성 세포를 흡인합니다.
10% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM/F-12 2-3밀리리터를 웰에 첨가합니다. 부착 세포를 표준 배양 조건에서 10-12일 동안 유지하여 연골형성 전구 세포 또는 CPC 클론을 얻은 다음 0.125% 트립신 EDTA를 사용하여 CPC 클론을 180초 동안 분리한 다음 5제곱센티미터당 클론 1개의 비율로 재생합니다. 농축된 다클론 CPC를 필요한 confluence까지 확장합니다.
피브로넥틴 접착 분석을 받은 연골세포는 클론 성장을 나타내며 10일째까지 개체군이 5배로 증가했습니다. 먼저 보충된 DMEM/F-12 배지에서 수확된 관절 관절에서 면도한 연골 외식식물을 얻습니다. 외식이 담긴 접시를 섭씨 37도로 설정된 이산화탄소 인큐베이터에 48시간 동안 놓습니다.
2일 후, 효소 분해를 위해 10ml의 0.1% 콜라겐분해효소 용액이 들어 있는 원심분리 튜브에 외식제를 옮깁니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 튜브를 배양합니다. 소화 후 1X PBS로 외식식물을 헹구고 새로 보충된 DMEM/F-12 배지가 들어 있는 플레이트의 동일한 웰로 다시 넣습니다.
표준 배양 조건에서 인큐베이터의 플레이트를 유지하고 이후 며칠 동안 연골 형성 동물의 이동을 모니터링합니다. 외식이 subconfluence에 도달하면 0.125% 트립신 EDTA 용액을 사용하여 중간엽 연골 형성자 세포(MCP)를 수확합니다. 보충된 DMEM/F-12 매체를 사용하여 MCP를 확장합니다.
연골 형성 동물은 배양 10일째까지 외식의 가장자리에서 이동을 시작하며, 추가 확장과 함께 방추 모양의 성장 패턴을 나타냅니다.
