우리는 세포내막의 융합 메커니즘을 연구하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 이 프로토콜에서는 smFRET에 의한 GTP 가수분해 주기 동안 소포체 막 융합 단백질 아틀라스틴의 구조적 역학을 실현하는 것을 목표로 합니다. Atlastin은 GTP 가수분해 주기에서 단량체 또는 이량체로 존재할 수 있습니다.
단일 분자 실험에서는 적절한 단백질 라벨링 및 고정 전략을 찾는 것이 어려우며, 다음은 GTP 가수분해 주기 전반에 걸쳐 아틀라스틴의 구조적 역학을 제시합니다. 벌크 FRET와 비교하여 smFRET는 다양한 뉴클레오티드 로딩 상태에서 단백질 구조를 정확하게 모니터링할 수 있으므로 조절체 분자의 거동에 대한 직접적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. 다양한 위치 전략 동안 아틀라스틴의 GTP 가수분해 주기를 완전히 해결하기 위해 smFRET를 사용했습니다.
우리는 우리의 발견이 GTP 가수분해 단백질 연구에서 더 많은 구조적 역학을 촉진하고 희귀 생물학적 과정에 대한 새로운 해석을 제공할 것이라고 믿습니다. 커버 슬립의 표면을 청소하려면 핀셋을 사용하여 8개의 커버 슬립을 집어 얼룩 항아리에 넣습니다. 커버 슬립을 덮기 위해 50ml의 아세톤을 추가하고 염색 용기를 초음파 세척기에 30 분 동안 넣습니다.
커버 슬립을 이중 증류수로 세 번 헹구고 초음파 세척기에서 메탄올로 씻으십시오. 다음으로, 염색 용기에 피라냐 용액을 넣고 수조 주전자에서 섭씨 95도의 수조에 2시간 동안 가열합니다. 항아리를 실온으로 식힌 후 이중 증류수로 커버슬립을 6번 헹굽니다.
염색 용기에 메톡시드나트륨 용액을 넣고 초음파 세척기에 15분 동안 넣습니다. 커버슬립을 물로 헹군 후 염색 용기에 이중 증류수를 넣고 초음파 세척기에 15분 동안 넣습니다. 염색 용기에 커버슬립을 고정하고 질소로 건조시킵니다.
건조된 커버슬립을 다른 염색 용기에 옮기고 섭씨 120도의 건조 오븐에서 30분 동안 항아리를 굽습니다. 그런 다음 데시케이터에서 항아리를 실온으로 식힙니다. 비커에 메탄올 47.5ml, 아세트산 2.5ml, 트리에톡시실란 0.5ml를 넣고 골고루 섞는다.
혼합물을 염색 용기에 옮기고 10분 동안 배양합니다. 염색 용기에 이중 증류수로 커버슬립을 세 번 헹구고 5분 동안 초음파 처리합니다. 커버슬립을 물로 헹구고 그림과 같이 질소로 건조시킨 후 커버슬립을 직경 10cm의 페트리 접시에 넣습니다.
SVA-mPEG와 SVA-mPEG-비오틴을 고염 용액에 1:100의 비율로 용해시킵니다. 준비된 믹스를 커버슬립에 떨어뜨리고 다른 커버슬립으로 덮습니다. 커버슬립을 적절한 습도로 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
수정 후에는 커버슬립을 분리하고 탈이온수로 헹구고 질소로 건조시킵니다. 수정된 커버슬립을 50밀리리터 튜브에 조심스럽게 넣습니다. Rosetta E.coli 세포에서 발현된 다이나민 유사 단백질 아틀라스틴 또는 ATL의 GTPase 도메인을 정제한 후 10킬로달톤 원심 필터를 사용하여 단백질 완충액을 단백질 비오틴화 완충액으로 변경합니다.
단백질 비오틴화의 경우, 100마이크로몰 ATP 100밀리리터, 아세트산 마그네슘 100밀리리터, D-비오틴 500마이크로몰, 100마이크로몰 BirA 비오틴 리가아제 10마이크로리터, 단백질 50마이크로몰을 최종 부피 1밀리리터까지 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 10킬로달톤 분자량 컷오프 원심 필터를 사용하여 유리 D-비오틴을 제거합니다.
20마이크로리터의 비오틴화 단백질과 20마이크로리터의 15마이크로몰 스트렙타비딘을 얼음에서 20분 동안 배양합니다. SDS-PAGE를 사용하여 단백질 비오틴화의 효율성을 검출합니다. LD555 및 LD655 형광단을 디메틸 설폭사이드에 최종 농도 5밀리몰로 용해합니다.
라벨링 버퍼를 준비하려면 25 밀리몰 HEPES, 150 밀리몰 염화칼륨 및 5 밀리몰 염화마그네슘을 혼합합니다. 10킬로달톤 원심 필터를 사용하여 단백질 완충액을 라벨링 완충액으로 변경합니다. 분자 내 smFRET 분석의 경우, ATL1cyto-TK와 LD555 및 LD655를 1:1.2:1.2의 비율로 100마이크로리터의 최종 부피에 혼합합니다.
혼합물을 섭씨 4도에서 5시간 동안 배양합니다. 분자간 smFRET 분석의 경우, ATL1cyto-K를 LD555와 함께 배양하고 비오틴화된 ATL1cyto-K를 LD655와 함께 섭씨 4도에서 5시간 동안 배양합니다. 단백질 고정실을 준비하려면 수정된 커버슬립과 현미경 슬라이드를 맞춤형 양면 테이프로 조심스럽게 붙입니다.
호스와 팁을 설치하여 6개의 채널이 있는 미세유체 챔버를 형성합니다. 매핑 보정을 위해 10마이크로리터의 10% 폴리스티렌 입자를 현미경 슬라이드에 추가하고 커버슬립으로 덮습니다. 그런 다음 전반사 형광 현미경에서 폴리스티렌 입자가 포함된 시야를 선택하고 명시야 모드에서 비디오를 캡처합니다.
사용자 정의 스크립트를 사용하여 공여체 채널과 수용체 채널 모두에서 동일한 폴리스티렌 입자의 중심 위치를 정렬합니다. 맵 파일을 TXT 파일로 저장합니다. 분자간 smFRET 실험의 경우, ATL1cyto-K로 표지된 LD555와 ATL1cyto-K-비오틴으로 표시된 LD655를 GTP-감마-S의 최종 농도와 1:1 비율로 혼합합니다.
혼합물을 얼음 위에서 1시간 동안 배양하여 단백질을 이합체화합니다. ATL1cyto-T 및 ATL1cyto-K 분자간 smFRET 실험을 위해 LD555 표지 ATL1cyto-T와 LD655 표지 ATL1cyto-K-비오틴을 1 밀리몰의 GTP-감마-S와 1:1 비율로 혼합합니다. 혼합물을 얼음에서 1시간 동안 배양하여 이합체화된 단백질을 얻습니다.
그런 다음 분자 내 smFRET 분석을 위해 LD555 및 LD655 표지 ATL1cyto-TK를 1 밀리몰의 GDP로 얼음에서 1 시간 동안 배양합니다. 분자간 실험의 경우, 스트렙타비딘 1밀리리터당 10마이크로그램을 10분 동안 배양하여 단백질을 고정시킵니다. 분자 내 분석의 경우, 밀리리터당 10마이크로그램의 비오틴화된 항-His 항체를 첨가하고 10분 동안 배양하여 단백질을 고정시킵니다.
배양 후 희석된 ATL1 이량체를 채널의 단백질에 첨가하고 10분 동안 고정시킵니다. incubation buffer로 채널을 두 번 플러시합니다. 벤조산과 PCD를 2.5 millimolar의 최종 농도로 채널에 추가합니다.
532 나노미터 레이저를 여기 광원으로 선택합니다. 30밀리초의 프레임 간격으로 데이터를 기록하도록 EMCCD 카메라를 설정합니다. 녹화된 동영상을 16비트 TIFF 형식으로 저장합니다.
데이터 수집 후 녹화된 동영상에서 FRET 트랙을 추출합니다. FRET 트랙을 선택하여 TXT 형식으로 저장합니다. TXT 파일에서 데이터를 추출하고 MATLAB에서 직접 만든 스크립트를 사용하여 FRET 값을 계산합니다.
Origin에서 GaussAmp를 사용하여 smFRET 데이터를 피팅하여 분포 히스토그램을 구합니다.
