우리는 제브라피시 배아를 사용하여 종양 세포가 약물에 어떻게 반응하는지 테스트하기 위해 빠른 7일 워크플로우를 개발했습니다. 소아 종양학에 밀접하게 관련되어 있어 희귀 암 샘플에 접근할 수 있으며, B세포 전구체 백혈병으로 시작했지만, 현재 고형 소아 종양에 대한 프로토콜을 채택하여 분석이 임상 환경에서도 효과가 있는지 확인하고 있습니다. 우리는 제브라피시 배아에서 환자 유래 백혈병 세포를 성공적으로 성장시킬 수 있으며, 이는 훌륭한 전임상 모델입니다.
그러나 일부 약물은 생물학적 장벽을 넘기 위해 고군분투하기 때문에 약동학은 까다로울 수 있으므로 실험을 시작하기 전에 침투를 테스트해야 합니다. 우리의 접근 방식은 선천성 면역 세포 분화를 차단하여 백혈병의 이식 세포가 더 잘 생존할 수 있도록 돕기 때문에 독특합니다. 또한 유세포 분석을 사용하여 10개의 숙주 물고기 풀에 있는 이식 세포에서 단일 세포 생존력과 증식을 측정하고 있습니다.
이를 통해 매우 정확한 약물 반응 데이터와 큰 통계적 힘을 얻을 수 있습니다. 먼저 100ml의 E3 배지에 1%아가로스를 녹입니다. 이식 플레이트의 경우 약 20ml의 배지를 10cm 페트리 접시에 붓고 반쯤 채웁니다.
접시를 부드럽게 휘젓어 액체를 고르게 분배합니다. morpholino 사출 플레이트의 경우 두 개의 페트리 접시에 있는 액체 아가로스에 사출 금형을 놓고 기포가 형성되지 않도록 합니다. 뚜껑을 기울여 접시를 덮고 아가로스가 굳을 때까지 실온에 둡니다.
아가로스가 굳으면 밀봉된 비닐 봉지에 접시를 섭씨 4도에서 거꾸로 보관하십시오. 다음으로, 바늘 풀러를 사용하여 10cm 모세혈관에서 바늘을 생성합니다. 바늘 끝을 잘라 10 마이크로 미터의 예상 직경을 얻으십시오.
모르폴리노를 주입하려면 최소한의 액체로 100개의 수정란 제브라피시 알 배치를 이전에 준비된 주입 플레이트로 옮깁니다. 배아를 플레이트의 홈에 조심스럽게 정렬합니다. spi1 및 csf3r 모르폴리노의 50마이크로몰 혼합물 1나노리터를 세포 또는 단일 세포 단계 동안 세포 바로 아래의 난황 자루에 주입합니다.
주입된 난자를 섭씨 28도에서 하룻밤 동안 부화시킵니다. 셋째 날에는 결핵 형성을 시작하기 위해 파스퇴르 피펫을 사용하여 심장 박동이나 움직임이 보이지 않거나 불투명하게 보이거나 불규칙한 모양을 가진 죽은 배아를 접시에서 제거합니다. 두 개의 정밀 집게를 사용하여 융모막을 꼬집어 제자리에 고정합니다.
집게 끝 부분을 꼬집으면서 두 번째 집게 세트로 배아를 고정합니다. 융모막을 조심스럽게 당겨 분리하여 배아를 방출합니다. 탈피된 배아를 섭씨 28도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
시작하려면 페니실린 스트렙토마이신 또는 E3/P/S가 보충된 E3 배지로 채워진 10cm 페트리 접시 2개를 준비합니다. 접시를 섭씨 28도에서 30분 동안 예열합니다. CellTrace Violet 또는 CTV로 형광 세포 표지 후 BCP-ALL 세포를 원심분리합니다.
그런 다음 PBS를 첨가하여 원하는 세포 농도를 얻고 얼음 위에 보관하십시오. 4마이크로리터의 세포 현탁액을 마이크로로더 팁을 사용하여 이식 바늘에 로드합니다. E3/P/S 배지 및 어류 배아가 있는 페트리 접시에 트리카인을 첨가하여 주입 전 최소 2분 동안 배아를 마취하기 위한 리터당 4g의 최종 농도를 달성합니다.
다음으로, 15-20개의 탈부착 배아를 아가로스로 코팅된 주사 접시에 옮기고 배아가 미끄러지지 않도록 여분의 액체를 제거합니다. 주사 접시에 배아를 배열합니다. 등쪽 방향에서 45도 각도로 바늘을 도입하여 약 1, 000 CTV 양성 BCP-ALL 세포를 심낭강에 주입합니다.
15-20개의 배아가 주입되면 E3/P/S 배지로 채워진 예열된 페트리 접시로 옮깁니다. 이식된 배아와 이식되지 않은 대조군을 모두 섭씨 28도에서 1-3시간 동안 배양합니다. 형광 실체 현미경으로 배아를 스크리닝하여 성공적인 생착을 확인하고 난황이 손상되지 않았는지 확인합니다.
100 웰 플레이트의 각 웰에 100 마이크로 리터의 E3 / P / S 매체와 0.5 % DMSO를 추가합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 E3 배지로 생착된 배아를 집습니다. 배아가 피펫 팁의 바닥으로 가라앉을 수 있도록 피펫을 기울이고 모세관 힘을 사용하여 웰로 방출합니다.
96웰 플레이트의 24웰에 100마이크로리터의 차량 제어 용액 또는 2배의 농축 베네토클락스 용액을 채웁니다. 이식되지 않은 배아를 대조군으로 포함하여 배아를 섭씨 35도에서 72시간 동안 유지합니다. 3일째가 끝나면 인큐베이터에서 생착된 제브라피시 배아가 들어 있는 96웰 플레이트를 제거합니다.
건강한 제브라피시 배아를 식별하고 선택하기 위해 실체 현미경을 사용하여 플레이트를 스크리닝합니다. 각 조건의 10개 숙주 배아를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 무작위로 풀링하여 조건당 2개의 튜브를 만드는 것이 이상적입니다. 각 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오.
각 튜브에 500마이크로리터의 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS를 추가합니다. 200마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 약 15회 위아래로 피펫팅하여 배아와 이식 세포를 기계적으로 해리합니다. 튜브를 350g으로 실온에서 5분 동안 원심분리하여 조직 조각을 펠릿화합니다.
조건당 2밀리리터의 PBS가 들어 있는 35마이크로미터 미세 메쉬 필터 스트레이너 캡이 있는 FACS 튜브를 준비합니다. 그런 다음 펠릿을 500마이크로리터의 효소 혼합물에 재현탁시키고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 중에는 조직 손실을 방지하기 위해 각 튜브에 대해 동일한 피펫 팁을 사용하여 5분마다 혼합물을 위아래로 피펫팅합니다.
해리된 세포를 FACS 튜브의 35마이크로미터 미세 메쉬 필터 스트레이너 캡으로 옮깁니다. 튜브를 350g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이식 세포의 총 수를 평가하기 위해 유세포 분석을 수행합니다.
CTV 및 CD19 염색 3dpi 배양 세포로 데이터 분석을 시작합니다. CD19 및 CTV로 점도표를 만들어 신호가 중복되는지 확인하고 이중 염색된 암세포의 존재를 확인합니다. 다음으로, FSC-A 및 SSC-A로 점도표를 만들어 온전한 세포와 파편을 구별합니다.
그런 다음 온전한 세포 집단을 사용하여 SSC-A 및 SSC-H로 새 플롯을 만들어 단일 세포를 식별합니다. 단일 세포 집단을 사용하여 7AAD 및 Annexin V로 점도표를 만들어 세포를 4개의 집단으로 구별합니다. 생착된 제브라피쉬의 파일을 엽니다.
CTV 및 CD19와 함께 점도표를 사용하여 숙주 세포에서 인간 이식 세포를 분리합니다. CTV, CD19 이중 양성 이식 세포를 식별하고 분리합니다. 3dpi 배양 세포에 대해 설명된 것과 동일한 게이팅 전략을 이식 세포 집단에 복사하여 적용합니다.
모든 Annexin V 및 7AAD 음성 세포 집단을 x축에 CTV 값이 있는 히스토그램으로 병합합니다. 5개 표본 모두에 대한 기하 평균을 계산하여 증식 속도를 확인합니다. 유세포 분석 데이터에 따르면 제브라피시 배아에 생착된 신선한 BCP-ALL 단일 세포는 3일 후 95.2%의 생존율을 보였으며, 이는 접시 배양 세포의 61.9%의 생존율보다 1.5배 높은 수치입니다.
in vivo 및 in vitro 조건에서 CTV 형광 강도는 3일 동안 비슷하게 감소했으며, 이는 유사한 세포 분열 속도를 나타냅니다. 3일 후 배아당 온전한 이식 세포를 각 풀에서 정량화하여 일관된 생착을 나타냅니다.
