우리의 프로토콜은 다른 분자 분석 방법과 호환되며 약물이 조직 조각의 생존 가능성과 중간 처리량 스크리닝의 성능에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 아주 작은 사전 또는 사후 처리와 실시간으로 전체 조직 조각의 생존가능성을 측정할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 환자 종양 조직 샘플에서 직접 획득한 약물 후보 또는 조직 조각을 테스트하여 전임상 약물 개발 및 종양학을 가속화합니다.
우리의 실시간 조직 생존 능력 평가 방법은 매우 다양하며 암 생물학, 신경 과학 및 발달 생물학 연구에 적용 될 수 있습니다. 실행 가능한 조직 조각을 준비하는 것은 절차의 성공의 열쇠입니다. 중간 조성물의 진동 설정은 조직 유형 및 탄력에 따라 조정되어야 합니다.
종양 조직 슬라이스 수집 당일, 24웰 플레이트에서 잘 당 조직 슬라이스 배양 배지의 250 마이크로리터를 각 우물에 삽입한다. 그런 다음 플레이트를 사용 전까지 5%의 이산화탄소로 가습된 인큐베이터37도에 놓습니다. 종양 조직 단편을 획득하기 위해, 10센티미터 배양판에 얼음 감기 HBSS에 종양 조직을 침수하고 메스를 사용하여 조직을 반으로 자른다.
6mm 생검 펀치를 사용하여 종양 조직의 실린더를 획득하고 각 실린더의 한쪽 끝을 다듬어 평평한 표면을 만듭니다. 티슈 조각을 신선하고 차가운 HBSS에 놓고 진동을 켭니다. 70%의 에탄올로 모든 장비를 소독하고 진동 유리 뚜껑으로 덮인 진동완유리 트레이를 진동얼음 욕조 중앙에 놓습니다.
목욕에 얼음을 추가하고, 차가운 HBSS로 버퍼 트레이를 채웁니다. 면도날을 블레이드 홀더에 적재하고 이빨이 있는 집게를 사용하여 생검 펀치 종양 샘플을 신중하게 선택합니다. 시편 접시에 의료등급 시아노아크라일레트 접착제 한 방울을 넣습니다.
여분의 버퍼를 제거하고 수직 안정 위치에 드롭에 조직의 실린더를 장착보풀이없는 종이 타월의 조각에 조직을 두드려. 2~3분간 의 공기 건조 후, 접시를 완충트레이에 넣고 조직이 완충제에 완전히 침지될 때까지 트레이에 HBSS를 추가합니다. 그런 다음 아이스 트레이와 버퍼 트레이 어셈블리를 진동에 넣고 팔을 잠그면 진동을 조립합니다.
진동 절단 두께를 250 마이크로미터로 설정하고 진폭은 3mm로, 슬라이스 속도는 초당 0.01 내지 0.25 밀리미터, 블레이드 각도를 15~21도로 설정합니다. 블레이드의 시작 및 끝 위치를 설정하고 스테이지의 높이를 조정합니다. 연속 모드에서 계측기를 실행하여 조직이 균일하게 절단될 때까지 여러 사이클동안 슬라이스를 잘라냅니다.
이전에 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 슬라이스와 소량의 HBSS를 개별 세포 배양 인서치로 옮기고 양에서 초과 버퍼를 제거하기 위해 Biped미세 팁 전달을 사용하여 Biped의 넓은 팁 전달을 사용합니다. 샘플의 끝에 도달하면 새로운 조직을 장착하고 충분한 샘플을 획득할 때까지 추가 조각을 얻습니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 조직 조각을 24~48시간 동안 배양한다.
조직 조각의 생존가능성을 측정하기 위해, 제조자의 지시에 따라 신선한 조직 슬라이스 배양 배지에서 1~1,000개의 희석을 포함하는 발광 기반 생존력 측정 시약을 준비하고 24웰 플레이트의 각 웰내배지를 혼합물로 교체한다. 각 조직 조각에 50 마이크로리터의 효소 기판 혼합물을 넣고 접시를 가습된 인큐베이터 내부에 궤도 셰이커에 넣고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 부드러운 교반을 합니다. 다음 날 아침, 적절한 설정을 사용하여 마이크로 플레이트 판독기의 각 우물에서 발광 신호를 측정합니다.
조직 슬라이스의 기준선 생존가능성을 결정한 후, 조직 슬라이스 배양 배지에 관심이 있는 약물을 용해하여 10배 스톡 용액을 얻고 각 조직 슬라이스의 하단에 배양 배지에 각각의 10배 약물 용액을 잘 첨가한다. 각 우물의 바닥에서 각 조직의 바닥에서 약의 50 마이크로 리터를 전송하고 하룻밤 궤도 셰이커에 조각을 반환합니다. 다음 날 아침, 적절한 실험 시점에서 마이크로플레이트 판독기의 각 조직 샘플에서 발광 강도를 측정하지 않고 배양판을 하위 배양 인큐베이터로 이송한다.
각 시점에서 처리된 종양 조직의 생존가능성은 표시된 대로 방정식을 사용하여 계산될 수 있다. 마우스 유방암 종양 샘플로부터 제조된 조직 슬라이스의 생존가능성은 간헐적인 중간 교환을 통해 적어도 21일 동안 유지될 수 있다. 4일 동안 다키나아제 억제제를 사용하여 치료하는 것은 디메틸 설옥사이드로 치료된 종양 조직을 대조하는 것에 비해 발광 신호 강도를 100배 감소시킨다.
동일한 억제제의 절반 농도를 가진 치료는 1일 초에 발광을 감소시키고 4일째에 가장 낮은 수준에 도달하며, 이후 측정된 각 시점마다 낮은 수준을 유지합니다. 대조적으로, 통제된 종양 조직 단의 발광 강도는 6일 배양 내내 안정되어 있습니다. 또한, 4일간 억제제의 직렬 투여를 통해 마우스 유방암 종양 슬라이스의 치료는 약물의 절반 최대 유효 농도에서 슬라이스 생존도의 용량 의존적 변화를 보여 준다.
표준 화학요법 약물인 독소루비신으로 치료된 환자 유래 이종이이식은 생존가능성에 따라 용량 의존적인 변화를 나타낸다. 또한, 단일 벌크 환자 유래 xenograft에서 제조된 조직 조각에 대한 삼중검사 및 임상승인 약물의 테스트는 원문 종양 미세 환경으로 종양 슬라이스에서 중간 처리량 약물 스크리닝을 수행할 수 있다는 개념의 증거를 제공한다. 종양 조직 샘플을 준비할 때 조직을 손상시키지 않도록 조직 조각과의 접촉을 최소화하십시오.
우리의 방법은 조직에서 공간 및 단세포 정보를 얻기 위해 IHC, 유동 세포 분석 또는 단일 세포 염기서열분석과 같은 다른 접근법과 결합될 수 있습니다. 우리의 기술은 시간이 지남에 따라 생리 적 조건하에서 다양한 복용량에서 관심의 여러 약물의 효과의 테스트를 허용합니다. 알려지지 않은 병원균 상태를 가진 종양에서 조직 조각을 준비할 때, 생물 안전 캐비닛에 있는 모든 절차를 수행해야 합니다.
