이 프로토콜은 난소 조직에서 박테리아를 발견하고 그들의 기능을 예측하도록 설계되었습니다. 면역조직화학 염색 및 16S rRNA 염기서열분석은, 암 및 비암 난소 조직에서 박테리아를 발견하고 구별하기 위해 사용하였다. 박테리아의 보상 및 기능적 차이는 관찰되지 않은 일의 재건에 의해 지역 사회의 BoPs 및 세포 유전 조사를 사용하여 예측됩니다.
우리의 프로토콜은 현장에서 난소 조직에서 박테리아를 추출하는 것을 목표로합니다. 그것은 또한 어떤 종류의 종양에 박테리아를 발견 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점은 거의 모든 실험실에서 실현 될 수 있다는 것이 쉽고 편리하다는 것입니다.
또한 결과를 얻는 것도 빠를 것입니다. 프로토콜에서 연습 하는 동안, 어떤 박테리아 오프 사이트 종양 조직을 제외 하는 것이 중요. 따라서 이 프로토콜의 모든 절차는 멸균되어야 합니다.
수술 중, 새로운 멸균 핀셋한 쌍으로 대략 1센티미터 두꺼운 조직 견본으로 분리된 난소를 분리합니다. 전체 절차 중에 다른 것을 만지지 마십시오. 분리 후, 샘플을 멸균 튜브로 제거하고 전송을 위해 액체 질소에 넣습니다.
영하 80도에서 샘플을 보존하십시오. 포르말린에 의해 조직을 수정한 다음 파라핀으로 포함시면 됩니다. 이 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
조직은 더 이상 보존을 위해 실온에서 보관할 수 있습니다. 추가 단계를 작동하려면 5마이크로미터 직렬 섹션에서 샘플을 잘라냅니다. 그런 다음 샘플을 건조시.
샘플에 파라핀을 제거하고 수분을 보충하십시오. 항원을 회수하려면 EDTA 버퍼에서 10 분 마이크로 파 처리가 필요합니다. 0.3%의 수소를 함유한 PBS의 샘플을 찍어보세요.
내인성 과산화증 활동을 중지하기 위해 20 분 동안 과산화하십시오. LPS 코어에서 항체 EMA를 수행, 1 이상 300의 농도. 그리고 섭씨 4도에서 하룻밤을 유지하십시오.
박테리아를 발견하기 위해, HRP의 존재를 감지하기 위해 DAP 기판 키트를 사용합니다. 제조업체의 지침을 기반으로 HRP 폴리머, 토끼 방지 항체를 사용합니다. 테이블 농축기를 사용하여 항체가 완전히 결합될 수 있도록 하십시오.
PBS를 사용하여 결합되지 않은 항체를 제거하십시오. 제조업체의 지시에 따라 화학 물질 염색을 한 다음 물 속의 샘플을 플러시하십시오. 시료에 탈수 작업을 수행합니다.
서명하여 샘플을 다수 매치합니다. 그리고 제조업체의 프로토콜에 따라 이미징 Pro Plus 준비 라이브러리를 사용하여 샘플로 입력합니다. 유전자 특이적 서열및 일루미나 어댑터 오버행 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머 패턴을 연습한다.
rRNA 유전자 서열에 대한 세균 16s의 V4 부위의 출생률을 증폭시키기 위해, 앰플리톤 PCR을 사용하여 DNA 샘플 입력으로부터 템플릿을 증폭시한다. 매그 바인드 RxNPure Plus 마그네틱 비즈를 사용하여 PCR 제품에서 반응 믹스를 제거합니다. 인덱싱된 PCR 증폭을 두 번째로 수행합니다.
애질런트 2200 TapeStation을 사용하여 라이브러리를 확인합니다. 정량성기 dsDNA 시스템을 사용하여 라이브러리를 정량화합니다. 600 사이클로 v3 표준 유량 셀은 약 100, 000 쌍의 끝을 생성합니다.
2회 300베이스 3. 라이브러리는 정규화, 풀풀 및 시퀀스됩니다. 모든 샘플의 원시 속도는 Trimmomatic에 의한 시퀀싱 품질을 기준으로 여과됩니다.
프라이머와 어댑터 시퀀스는 모두 제거해야 합니다. 시퀀스는 쌍으로 읽으며 25미만의 자질을 모두 줄여야 합니다. 소프트웨어 패키지 QIIME에 의해 16s rRNA를 분석합니다.
OtUs의 경우 유사성 컷오프가 있는 OtUs를 형성하기 위해 서열을 수집하면 각 샘플에서 상대적 풍부를 계산해야 합니다. 모든 시퀀스를 정렬하기 위해 RDP 교육 세트에 있는 Bayesian 분류기를 사용합니다. 주어진 OTU를 사용하면 시퀀스의 주요 일관성을 갖는 분류가 OtUs에 할당됩니다.
OtUs는 샘플 그룹 정보를 기반으로 실바 데이터베이스에 정렬됩니다. 알파 다이버시티 및 UniFrac 기반 주좌 분석을 수행합니다. 박테리아의 특성의 관련 프리젠 테이션을 예측하려면 BugBase를 사용합니다.
PICRUSt에서 대사유전체의 기능적 조성을 예측한다. 모니터링 데이터와 참조 게놈을 포함하는 데이터베이스를 사용하여 STAMP 소프트웨어의 도움으로 각 그룹 간의 다양한 기능을 분석합니다. 하나의 통계 소프트웨어를 사용하여 결과를 계산합니다.
통계적 유의의 표시는 0.05 미만의 p로 설정해야 합니다. 학생의 t-시험에 의해 연령과 패리티를 포함하는 혼란스러운 요인을 계산합니다. 치스퀘어 검사를 통해 갱년기 상태, 고혈압 및 당뇨병의 병력을 계산합니다.
Mann-Whitney U 테스트에 의해 난소 박테리아 택시의 수를 계산합니다. 16명의 환자는 이 연구 결과에 등록되었습니다. BugBase는 예측된 대사유전체의 분석을 연습하기 위하여 이용되었습니다.
항균 LPS 항체를 사용하여 난소의 잠재적으로 병리유전학 및 면역 조직 화학. 이 그림은 암과 대조군의 세균풍 풍부함과 다양성을 보여줍니다. 16S rRNA 시퀀싱에 의해 공개.
수치는 관찰된 종 지수입니다. 차오1 지수, ACE 지수, 섀넌 지수, 어벤니스 지수, 심슨 지수. 필라의 상대적 풍부와 난소 샘플에서 가장 풍부한 12 개의 가장 풍부한 박테리아 종은이 그림에 표시됩니다.
도 A, B, C 및 D.는 대조군 및 난소암 군내 환자의 난소에서 패널의 상대적 풍부를 의미한다. 대조군 환자와 난소암 그룹의 난소에서 가장 풍부한 12 종의 상대적 풍부. 이것은 일반적인, PCoA와 Anoxynatronum sibiricum와 메타노 사르키나 vacuolata의 상대적인 풍부를 사용하여 클러스터.
그림 A는 PCoA를 사용하여 클러스터된 일반적인 것을 보여줍니다. PC1및 PC2는 x와 y축에 플롯됩니다. 적색 블록은 난소암 그룹의 샘플과 동일하다.
파란색 원은 대조군의 샘플과 같습니다. 난소암 군으로부터의 샘플은 대조군내 다른 샘플로부터 분리될 수 있다. 그림 B는 PCoA를 사용하여 클러스터된 일반적인 것을 보여줍니다.
PC1 및 PC2는 x 및 y 축에 플롯됩니다. 빨간 블록은 난소암 그룹의 샘플과 동일하다. 파란색 고체 원은 자궁 근종을 가진 환자로부터의 샘플과 같습니다.
그리고 파란색 중공 원은 자궁 아데노미증을 가진 환자의 샘플과 같습니다. 도면 C는 안옥시나트로눔시비리쿰의 상대적 풍요로움을 나타낸다. 그림 D는 메타노사르시나 바쿠올라타입니다.
이 수치는 예측 된 메나게노믹스의 BugBase 분석입니다. 암 군내 난소의 잠재적으로 병리유전학적 및 산화 스트레스 내성 표현형은 대조군보다 강했다. 이 수치는 PICRUSt 분석에 의한 암과 대조군 사이의 KEGG 경로 공간이 현저히 다르다.
시료를 받으면 새로운 멸균 핀셋이 필요합니다. 시료에 대한 잠재적 오염에 주의를 기울이십시오. 그 박테리아 오프 사이트 종양 조직 크게 해결에 영향을 미칠 수 있습니다.
제어 그룹을 모든 단계로 설정하는 것이 좋습니다. 잠재적 인 오염의 효과를 줄이기 위해.
