Zebrafish xenograft 약물 스크리닝 워크플로우를 통해 인간 암세포의 자동 이미징 및 정량화 및 약물 치료에 대한 반응을 허용합니다. 그것은 빨리 알려진된 약에 인내의 암세포의 반응을 시험하거나 새로운 항암 성 화합물을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. Zebrafish xenograph 모델 및 약물 스크리닝을 사용하면 이전에는 체외 시스템에서만 얻을 수 있었던 Inviva 복제 번호를 사용할 수 있습니다.
또한 큰 화합물 라이브러리를 통해 스크리닝할 때 마우스 모델보다 훨씬 더 비용 효율적입니다. 이 워크플로우는 제브라피시에 있는 암세포의 간섭에서 시각적 데모에 의해 가장 잘 배운 약 반응의 화상 진찰에 몇몇 단계가 있습니다. 시작하려면, 원심분리는 5분 동안 200배 g에서 PBS의 5밀리미터에서 6세포에 최소 2배 10을, 과부를 흡인한다.
디이 염색 용액의 5 밀리미터에서 세포 팔레트를 다시 중단합니다. 20 분 동안 빛으로부터 보호 되는 섭씨 37도에서 세포를 배양. 그런 다음 부드럽게 소용돌이와 빛으로부터 보호 15 분 동안 얼음에 세포를 배양.
그런 다음 세포를 5 분 동안 200 배 g로 원심 분리하고 수퍼나탄을 흡인시합니다. PBS의 5 밀리리터를 추가하고, 5분 동안 200배 g에서 원심분리하고, 상퍼를 흡입하여 세포를 세척합니다. 세탁을 한 번 더 반복합니다.
250,000 개의 살아있는 세포 당 PBS의 1 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 1.5 밀리미터 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 다시 매달린 세포를 어둠 속에서 얼음 위에 두십시오. 세포를 염색하고 주입하기 전에, 1X TBE에 3%의 아가로즈 25밀리레이를 부어 주입을 위한 아가로즈 플레이트를 만들어 페트리 접시에 넣고 고화시키도록 합니다.
최대 2주 동안 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 또한 세포를 염색하고 주입하기 전에 해부 현미경으로 집게를 사용하여 2 일 간의 후 수정 얼룩말 물고기를 탈염시합니다. 초리온이 눈물과 얼룩말 물고기가 봉투가 될 때까지 집게와 얼룩말 물고기의 보호 초리온의 반대쪽 끝에서 당겨.
미세 주입 중 세포의 응집을 방지하기 위해, 전 냉각 비 필라멘트 borosilicate 유리 바늘은 섭씨 4도 또는 얼음에. 세포를 염색한 직후 마이크로로더 파이펫 팁을 사용하여 염색된 셀의 5마이크로리터를 차가운 바늘에 적재합니다. 바늘을 마이크로인젝터 암에 넣습니다.
멸균 면도날을 사용하여 바늘 끝을 평평하게 합니다. 단계 마이크로미터를 사용하여 미네랄 오일의 액적 크기를 측정합니다. 두 나노 리터에서 지속적으로 물방울 볼륨을 유지, 이는 직경 약 1.5 밀리미터입니다.
마취 후 1 분, 마취 유충을 3 % 아가로즈로 준비 된 평평한 표면 사출 판으로 옮기고 원하는 주사 부위에 스테인드 셀 1 펌프로 애벌레를 주입하십시오. 모든 주사는 바늘의 응집을 방지하기 위해 세포를 염색 한 후 1 ~ 3 시간 이내에 완료해야합니다. 사출 판에서 유충을 메틸렌 블루 없이 E3 미디어를 함유한 10센티미터 페트리 접시에 넣고 1시간 동안 섭씨 28도에서 배양합니다.
주입된 애벌레의 접시를 섭씨 34도 인큐베이터로 옮킨다. 선반과 애벌레의 페트리 접시 사이에 빈 페트리 접시를 놓아 버퍼 역할을합니다. 48 시간 후 주입에서, 형광 종양 세포 이식 및 건강을 위한 얼룩말 물고기 애벌레를 스크린합니다.
죽은 또는 기형 얼룩말 물고기를 제거하고 유사한 이식 얼룩말 물고기를 선택합니다. 이식되지 않은 얼룩말 물고기를 제거합니다. 노른자를 주입 한 물고기의 경우, 요크의 테두리가 이식 된 세포 질량 주위에 볼 수없는 물고기를 제거하십시오.
심낭 주입 된 물고기의 경우, 노른자 자루에 세포 질량을 주입 물고기를 제거합니다. 선택한 생선을 96웰 플레이트로 옮기려면 먼저 팁을 200 마이크로리터 파이펫 팁에서 잘라서 4일 동안 수정된 얼룩말 물고기가 들어갈 수 있을 만큼 충분히 커집니다. P200 파이펫을 사용하여 접시에서 얼룩말 물고기 1개를 가진 E3 미디어의 150 마이크로리터를 흡인하고 평평한 바닥 96웰 플레이트의 빈 우물에 추가합니다.
얼룩말 물고기 애벌레를 함유한 각 웰에 2X 희석 약물 용액 150마이크로리터를 추가하여 1X 약물 용액을 가진 300 마이크로리터의 최종 부피에 도달하십시오. 섭씨 34도에서 접시를 배양합니다. 매일 죽은 얼룩말 물고기를 확인하십시오.
2 일 후, 원하는 경우, E3 미디어에서 1X 약물 용액 또는 DMSO로 각 우물에서 200 마이크로 리터를 교체하여 약물을 새로 고칩니다. Zen blue 소프트웨어에서 이미징 소프트웨어의 원치 않는 모든 형광 채널을 제거하고 Dii 채널을 추가합니다. 원하는 형광 채널을 확인합니다.
같은 창에서 이미지를 촬영하는 방법, Z 스택, 자동화, 루프 및 시리즈, 등 세테라를 선택합니다. 약물 처리 물고기 전에 DMSO 제어 물고기를 이미지. 그리고 이미징 소프트웨어에서 적절한 노출 시간을 설정합니다.
형광을 정량화하려면 이미지를 엽니다. 원하는 CZI 파일을 파일로 이동하여 열고 선택합니다. 이 소프트웨어는 가져오기 옵션 창을 제공합니다.
스택 보기를 위해 하이퍼스택을 선택하고, 열려 있는 파일을 개별적으로 확인하고, 자동 축척을 확인하고, 분할 채널을 확인합니다. 색상 옵션을 보려면 색으로 선택합니다. 그런 다음 플러그인, 매크로, 레코드를 클릭합니다.
이미지를 클릭하고 조정하며 임계값을 설정합니다. 임계값 창의 오른쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 이미지 유형을 빨간색으로 선택합니다. 소프트웨어가 형광이 있는 영역만 강조 표시될 때까지 최소 임계값을 조정한 다음 적용을 클릭합니다.
이 소프트웨어는 선택한 영역이 검은색으로 사진을 흑백으로 변환합니다. 분석 및 측정을 클릭합니다. 소프트웨어는 해당 이미지에 대한 형광 영역이 포함된 결과 창을 가져옵니다.
매크로 레코더 창에서 만들기를 클릭합니다. 이렇게 하면 매크로에 대한 코드가 있는 새 창이 열립니다. 스태킹 보기 또는 색상 옵션에 따라 분석을 위해 원하는 이미지를 모두 강조 표시하고 엽니다.
매크로가 있는 창에서 실행을 선택합니다. 이제 결과 창에 각 이미지에 대한 영역이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에서, 48 시간 후 주입에서, xenografted 물고기는 형광표지 종양 세포를 위해 검열되고 화학요법 또는 DMSO로 취급되었습니다.
전반적으로, Vincristine로 취급된 xenografted 물고기는 DMSO 처리된 물고기에 비해 xenografted 세포 질량에 있는 가장 크고 가장 일관된 감소를 보여주었습니다. 덱사메타손 처리된 물고기는 빈크리스틴에 비해 종양 부위의 약 절반 감소를 보였다. 그러나 여전히 DMSO에 비해 종양 부위의 감소를 보였다.
이 절차는 각 환자의 종양에 대한 통찰력을 주는 다른 약 또는 특정 표적으로 한 치료에 대한 반응을 위해 어떤 암 세포 주 또는 환자 견본든지를 검열하기 위하여 이용될 수 있습니다.
