The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

주 :이 프로토콜은 기존 상업용 방울 방울 결정자 23,29 형성 할 수있는 미세 유체 소자를 제작하는 단계, 상기 분석에 대한 필요가 없다. 1. 물방울 형성​​ 미세 유체 소자를 확인 <ol><li> SU-8 마스터 제조 프로토콜에 채널 마스터 주형을 제조 이전 31 약술하지만 방울 생성기 마스크 패턴 (32). </li><li> 소프트 리소그래피 (32, 33)의 기술을 이용하여 PDMS의 장치를 제작. </li></ol> 2. 대량 물방울 판독에 대한 반응 믹스를 준비 주 : 프로토콜은 증폭 반응의 다양한 형태를 사용하여 핵산을 정량하는데 사용될 수있다. 예로서, 몇몇 람다 DNA 농도 MDA 필요한 시약 주어진다. 시약 세부 사항은 특정 시약의 표에 나열되어 있습니다. 액적 내의 템플릿의 분포에 의존 sufficien시료의 t 혼합. <ol><li> 구하거나 Purify를 Phi29 DNA 중합 효소. <ol><li> 이전에 공급 업체로부터 7 또는 구매 한 바와 같이 Phi29를 정화. 도시 된 실험에 사용 Phi29 정제 하였다. </li></ol></li><li> 65 mM의 KOH, 1.65 mM의 EDTA, 14 mM의 DTT로 구성된 변성 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. </li><li> 65 mM의 염산, 0.21 M 트리스 (CL)의 pH 7.0, 9 mM 트리스 - CL 산도 8.0 구성된 중화 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. </li><li> 이러한 뉴 클레아없는 물과 같은 두 가지 기준, 하나없이 템플릿 컨트롤 (NTC), 하나의 높은 템플릿 농도 (4 페이지 주변 / μL 람다 DNA)를 준비합니다. qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL 각 표준의 3.3 μl를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 3.3 μL 각을 끄다. </li><li> qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL를 사용하여 원하는 템플릿의 3.3 μl를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 3.3 μL로 담금질중화 버퍼의. </li><li> 얼음에 샘플 당 마스터 혼합물의 11 μl를 준비합니다. 배 MDA 반응 마스터 혼합물이 2 배 이중 가닥의 DNA로 구성 (dsDNA) 결합 염료, 배 qPCR에 참조 염료, 50 μm의 무작위 올리고, 2 ㎎ / ㎖ BSA, 배 Phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 4.8 밀리미터의 dNTPs, 뉴 클레아없는 물 및 40 μg의 / ㎖ Phi29 DNA 폴리머 라제. 잘 7.5.Mix보다 산도 수준이 매우 높거나 낮은 발생하지 않는 중합 효소를 보장하기 위해 지난 Phi29 DNA 중합 효소를 추가합니다. </li><li> 옵션 : 적은 오탐 (false positive)의 경우, 이전에 방울 (34)을 형성하는 자외선을 마스터 믹스를 노출. <ol><li> 얼음에 0.5 ml의 1.5 ml의 명확한 튜브 샘플 당 예비 혼합물의 10 μl를 준비합니다. 사전 혼합은 55 μm의 무작위 올리고, 2.2 ㎎ / ㎖ BSA, 1.1 Phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 5.3 밀리미터의 dNTPs, 및 뉴 클레아없는 물로 구성되어 있습니다. </li><li> (34) 기술로 얼음에 물에 튜브를 삽입하고 ACCU에 자외선 (254 nm의)에 노출5.7 J의 mulated 용량 / ㎠. </li><li> 사전 혼합물에 40 ㎍ / ml의 dsDNA 결합 배로 염료, 배로 참조 염료 및 Phi29를 추가합니다. 잘 섞는다. </li></ol></li><li> 변성 템플릿 또는 표준의 10 μL 마스터 혼합물의 10 μl를 결합합니다. 잘 섞는다. </li></ol> 3. 물방울 형성 참고 : 물방울 정전기 및 전단 응력에 매우 민감 할 수 있습니다. 정전기가 발생할 수 있습니다 옷을 제거하고 방울을 형성하기 전에 자신을 접지. 최대한 에멀젼에서, 튜브의 상부에서 튜브의 유제를 처리. 피펫 에멀젼 매우 느리게, 바람직하게는 넓은 구멍 피펫 팁과. 피펫 팁으로부터 송출되면, 피펫 속도를 결정하는 팁의 측면에 에멀젼 시계. <ol><li> 양식 방울. 실험은 도시의 경우, 마이크로 유체 장치는 오일 유입구와 방울을 생성하기위한 유동 포커싱 접합 두 수용액 유입구를 갖는다. 두 syri를 사용하여NGE 20,000 NL 1 방울을 생성하기 위해 마이크로 유체 칩을 통해 오일의 계면 활성제 및 55 μL의 반응 혼합물을 20 μL의 유량을 제어하는​​ 펌프. </li><li> 이것은 계면 활성제 많은 오일 소적을 함께 제조 할 수 있지만, 조성물은 매우 높은 온도에서 및 시간에 걸쳐 방울의 안정성에 영향을주는 것 : 참고. 하나의 가능한 조합은 음이온 성 계면 활성제와 19,35 불소화 오일 HFE 7500이다. </li><li> 임의의 방법 13,36 어떠한 크기로 액적들을 생성하지만, 액적 인구 크기 변동은 벌크 형광, 따라서 분석의 정확성에 영향을 미칠 것이다. 도시 된 실험에서, NL 1 방울의 양을 가진 단 분산했다. </li><li> PCR 튜브에 물방울과 오일을 모두 수집합니다. 각 샘플에 대해, 나누어지는 30 광학 모자와 신선한 PCR 튜브에 오일 μL, 오일 위에 방울의 20 μl를 전송합니다. 일관된 볼륨은 분석이 교류로인지 확인가능한 보좌 신부. </li><li> 닫기 튜브는 느슨한 모자는 오일이 증발 할 수로, 단단히 모자. </li></ol> 4. 등온 증폭 <ol><li> PCR 용 열 순환기, qPCR에의 열 순환기, 또는 핫 플레이트를 이용하여, 7 시간 동안 30 ° C에서 샘플들을 배양하고, 75 ℃에서 1 분 동안 불 활성화. 방울의 튜브는이 시점에서 몇 시간 동안 호일로 덮여 냉장고에 남아있을 수있다. </li></ol> 5. 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 즉시 qPCR에의 열 순환기를 이용하여 모든 샘플에 대해 형광 염료 농도를 측정하고, 반응을 불활 다음. 최적의 필터 설정은 염료의 여기 및 방출 스펙트럼에 의존 할 것이다. 예를 들어, dsDNA 염료 - 결합에 대해 설정 492 내지 516 nm의 필터 및 기준 염료에 대해 설정 585 내지 610 nm의 필터를 사용한다. 다른 형광 측정 기술은 형광을 정량하는 데 사용될 수있다. </li><li> 각 샘플에 대해,에 의해 결합 dsDNA 염료의 형광 강도를 분할기준 염료의 형광 강도. 모든 시료에서 배경 형광, 또는 아니 템플릿 제어 정규화 형광을 뺀다. </li><li> 표준에서 수정 된 형광 측정을 사용하여 선형 표준 곡선을 작성합니다. NTC 표준은 0 % 형광 방울과 샘플에 대한 형광 ( &quot;모든 부정&quot;)를 나타내며, 높은 템플릿 농도 형광 측정은 100 % 형광 방울과 샘플에 대한 기대 형광 ( &quot;모든 긍정적&quot;)입니다. 대응하는 표준 곡선을 사용하여, 그들의 대량의 형광에 기초하여 양 및 음의 액적 중간 비율을 예측한다. </li></ol> 6. 일으키기 방울 원리 증명 측정을위한 <ol><li> 형광 (포지티브) 방울을 0.1 ng를 람다 DNA, 1X dsDNA 결합 염료, 1X 기준 염료, 1.5 유닛의 Taq DNA 중합 효소, 10 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의 KCl을, 1.5 m 이루어진 PCR 반응 혼합물을 제조M의 MgCl 2, 0.2 밀리미터의 dNTP, 0.5 μM 프라이머. 전술 한 바와 같이 혼합물을 30 회 (20 초, 20 초, 1 분, 72 ° C, 55 ° C, 95 ° C) 열 순환 후 액 적을 형성한다. </li><li> 비 형광 (네거티브) 방울을 : 1X dsDNA 결합 염료 이루어진 PCR 반응 혼합물을 제조, 1X 기준 염료, 1.5 유닛의 Taq DNA 중합 효소, 10 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 0.2 mM의 dNTP를, 0.5 μm의 프라이머. 혼합물을 30 회 (20 초 동안 95 ° C, 20 초, 1 분, 72 ° C, 55 ° C)를 선택한 다음, 열 순환 액 적을 형성한다. </li><li> 미리 혼합 비율 액적 형성 <ol><li> qPCR에 튜브에 불소 오일의 20 μl를 배포, 증발을 방지 할 수있는 광학 캡 커버. </li><li> 오일의 상단에 부정적인 비율 : 부드럽게 원하는 양에 잘 혼합 된 방울의 10 μl를 피펫. 의 결과에 긍정적 인 : 음 방울 비율은 1 (모든 긍정적 인), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0 (모든 NEG했다극상). </li></ol></li><li> qPCR에의 열 순환기를 사용하여 모든 샘플에 대한 형광 염료 농도를 측정한다. 이 프로토콜의 경우, 결합 dsDNA 염료에 대해 설정 492 내지 516 nm의 필터 및 기준 염료에 대해 설정 585 내지 610 nm의 필터를 사용한다. <ol><li> dsDNA가 기준 형광 염료를 사용한 형광 염료 결합 정상화. 또한 &quot;모든 긍정적&quot;샘플의 형광으로 정상화. </li></ol></li><li> &quot;모든 긍정적&quot;과 &quot;모든 부정&quot;샘플에서 정규화 된 형광 측정을 사용하여 선형 표준 곡선을 작성합니다. 대응하는 표준 곡선을 사용하여, 그들의 대량의 형광에 기초하여 양 및 음의 액적 중간 비율을 예측한다. </li><li> 각각의 비율 (N = 3) 독립 방울 형성​​하고 각 복제에 대한 믹싱에 대한 실험을 반복합니다. </li></ol> 7. 원리 증명 MDA 실험 <ol><li> 사양과 람다 DNA 원액의 농도를 측정trophotometer. <ol><li> 물방울 당 평균 10 템​​플릿 분자에 필요한 템플릿 농도를 계산한다. 이 프로토콜의 경우, 방울 볼륨이 1 NL과 람다 DNA의 1 NG가 약 1.9 × 10 (7) 사본이 포함되어 있다고 가정. 따라서, 방울 당 10 템​​플릿은 NL 당 10 사본 또는 μL 당 526 FG 람다 DNA를 될 것입니다. 방울이 형성 될 때 주형 따라서 높은 초기 주형 농도 / μL 3.2 PG 것이다, ~ 6 배 희석한다. </li></ol></li><li> 직렬 변성 버퍼와 같은 부피의 중화 버퍼와 3.2 PG / μL로 람다 DNA를 희석. 0.1의 희석 배수를 들어, 변성 완충액 45 μl를 10 μl의 샘플을 조합하고 3 분 동안 RT에서 배양한다. 중화 버퍼의 45 LL은 해소에 추가. </li><li> 실험 샘플의 나머지 부분을 만드는 단계 7.2에 기재된 바와 같이, 상기 샘플을 희석한다. 표시되는 반응에서 초기 템플릿 농도는 3.2 페이지, 320 FG했다160 FG, 32 FG, 16 FG, 3.2 FG 및 마이크로 리터 당 1.6 FG. 참고 : mastermix 추가 후 최종 템플릿 농도는 526 FG했다, 52.6 FG, 26.3 FG, 5.26 FG, 마이크로 리터 당 2.63 FG, 526 AG, 263 AG. 방울 당 각각 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 예상 람다 사본. </li><li> 생성 및 단계 2.5-5.3에 설명 된대로 각 샘플에서 방울을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 디지털 카메라를 사용하여 도시 된 형광 영상 (도 2,3) RT에서 10 배의 대물 렌즈와 에피 형광 현미경에 장착 획득. 각 샘플에 대한보기의 열두 필드를 취득. 형광 슬라이드로 얻은 배경 이미지로 수정 형광 이미지. </li><li> 유화 오일이 빨리 증발로 영상 37 포함 된 실을 사용합니다. </li><li> ImageJ에 매크로 (보조 기호 파일)를 사용하여 개별 방울 강도를 분석합니다. <ol><li> 가장 N 비 형광 액 적을 분리 임계 형광 강도를 선택높은 템플릿 농도 이미지의 형광 방울에서 TC 이미지. 각각의 미지 시료에 대하여, 임계치 이상의 형광 강도와 방울의 비율을 계산한다. </li></ol></li></ol> 8. PCR 및 MDA 벌크 반응 <ol><li> PCR 반응을 준비합니다. <ol><li> 직렬 0.1 희석 배수와 템플리트 DNA를 희석. 각각의 희석, 변성 버퍼의 45 μL와 템플릿의 10 μl를 결합하고 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 45 μL로 희석을 결합합니다. </li><li> 샘플 당 PCR의 mastermix 20 μl를 준비합니다. 1.1 PCR 반응 마스터 혼합물의 Taq DNA 중합 효소 μL 60 대 / 11 mM 트리스 - 염산, 55mM의 KCl, 1.65 밀리미터의 MgCl 2, 0.22 밀리미터의 dNTP 구성, 1.1 염료, 1.1 참조 염료, 550 nm의 dsDNA 결합 각각의 프라이머. </li><li> 희석 템플릿의 2 μL 및 mastermix 20 μl를 결합합니다. 참고 : 최종 템플릿 농도 T에그는 도시 반응을 PCR 50 페이지, 5 페이지, 500 FG, 마이크로 리터 당 50 FG, 5 FG, 500 AG 및 0g 람다 DNA했고, 세중의에서 수행되었다. </li><li> 다음 프로그램 qPCR에 기계의 열 순환 PCR 반응. 2 분 동안 72 ℃에서 2 분 전에 30 초, 30 초, 20 초 동안 57 ° C, 72 ° C ~ 95 ° C의 40주기를 실행하고 4 ℃에서 유지. </li><li> dsDNA는 참고 염료 형광 이전에 추가 분석을 이용하여 염료 형광 결합 정상화. </li></ol></li><li> MDA 반응을 준비합니다. <ol><li> 단계 8.1.1에 설명 된대로 샘플을 희석. </li><li> 얼음에 샘플 당 마스터 혼합물의 11 μl를 준비합니다. 배 MDA 반응 마스터 혼합물 배 dsDNA 결합 염료, 배 기준 염료, 50 μm의 무작위 올리고, 구성 2 ㎎ / ㎖ BSA, 배 phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 4.8 밀리미터의 dNTPs, 뉴 클레아없는 물, 40 ㎍ / ㎖의 Phi29 DNA 중합 효소. </li><li> 40 μg의에 Phi29 DNA 중합 효소를 추가 / 중합 효소 개발을 위해 지난 ㎖로OES 7.5 이상의 pH 값이 더 높거나 낮을 발생하지. 잘 섞는다. </li><li> qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL로 희석 템플릿의 3.3 μL를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 3.3 μl를 추가합니다. </li><li> 변성 템플릿의 10 μL 마스터 혼합물의 10 μl를 결합합니다. 잘 섞는다. </li><li> 다음 프로그램 qPCR에 기계에서 MDA 반응을 실행합니다. </li><li> 형광마다 7.5 분을 측정, 4 시간 동안 30 ° C에서 잡으십시오. </li><li> 1 분 동안 75 ℃에서 비활성화. </li><li> dsDNA가 기준 형광 염료를 사용한 형광 염료 결합 정상화. 또한, 각 샘플의 최대 형광 의해 정상화. </li></ol></li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+detection+of+single-nucleotide+and+copy-number+variations+of+a+single+human+cell.">Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syringe-vacuum+microfluidics:+A+portable+technique+to+create+monodisperse+emulsions.">Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions.</a> Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).</li><li>Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip+for+the+versatile+chemical+analysis+of+single+cells.">A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (80), e50618 (2013).</li><li>Fainman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).</li><li>Xia, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G.M.+Softlithographie.">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).</li><li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification.">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).</li><li>Hindson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+hot-start+amplification+via+a+multiple+emulsion.">System for hot-start amplification via a multiple emulsion.</a> US patent. , (2014).</li><li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

디지털 분석법 희귀 세포의 검출 및 핵산 분자의 개인의 계산을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나, 디지털 분석은 여전히​​ 통상적으로 시판되는 방법과 관련된 특수 장비의 비용을 부분적으로 분석 실험실에서 기인인가되지 않는다. 여기서 우리는 표준 정량 실시간 PCR 기계를 사용하여 단순화 된 아날로그 판독하여 핵산을 정량 종점 디지털 분석법을 설명한다. 이 방법은 설정 신속하고, 판?...

핵산 정량 (디지털 PCR) 1-4 및 기본 순서 (서열)에 대한 디지털 분석은 강하게 생명 과학 및 의학에 영향을하고 있습니다. 디지털 분석은, 높은 감도를 제공하는 실험을 통해 용이 한 비교를 가능하게하고, 결정적으로, 비교 데이터 (5) (표 1)을 함유하는 큰 데이터베이스의 구성을 가능하게 절대치 스케일 (제어에 대해 생략)에 분자 계수의 정량화를 제공한다. 지난 15 년 동안, 전체 게놈 증폭 (WGA)은 핵산 증폭 용 PCR 일반 공구로 나란히 나타났다. PCR 원한다면, WGA는 용이하게 검출 또는 염기 서열 분석 등 후속 분석을 위해 사용할 수있는 레벨까지 분 샘플을 증폭 소자에 의해 분석하고 예비 애플리케이션에 유용하다. PCR 달리 WGA 오히려 미지 서열을 포함한 시료 중의 모든 서열의 증폭을 허용하는, 특정 DNA 유전자좌에 특이하지 않다.PCR 및 WGA 간의 기본적인 차이점은 서로 상보 만드는 방법 및 그 응용이 다른 과제가 발생한다. WGA 반응 (6)의 높은 수율은 단일 분자 (7), 단일 세포 (8) 및 정량 또는 추가 분석을 위해 다른 낮은 바이오 매스 샘플 9에서 게놈 DNA의 일상적인 증폭을 할 수 있습니다. WGA 화학와 관련된 주요 문제는 오염 물질에 극단적 인 감도와 개별 템플릿 분자 (6)에 걸쳐 고르지 증폭 있습니다. 단일 셀 시퀀싱 그러나 WGA는 얻고 인기가 WGA에 의해 WGA 기술 (10), 및 템플릿 정량의 &#39;킬러 애플리케이션&#39;로 떠오르고있다하는 응용 프로그램 (7)의 많은 분야에서 중요하다. 디지털 핵산 정량 계측 이전 판막과 미세 유체 valveless 견적 다양한 설명되었지만액적 기반 분석법을 포함한 TS 11-14, 15, 16 (표 2). 그러나 디지털 분석을위한 상업 미세 유체 시스템은 반응 설치 및 제품 감지 (17)에 대한 전문적인 장비를 필요로한다. 사용자 정의 판막 미세 유체는 유연하지만, 정밀 미세 가공 및 공압 제어 시스템 (18)을 필요로한다. 이 에멀젼 계 디지털 분석법 19,20 용 단 분산 미세 방울을 만드는 비교적 간단하지만, 디지털 판독 대규모 와이드 필드 영상 중 하나를 요구하는 (인기있는 차세대 시퀀싱 기술과 유사) 기술적 부담이다 (21, 22) 또는 고속 액적 검출 23-25 ​​흐름 기반. 이상적으로, 디지털 분석은 복잡한 장비에 대한 필요성을 감소시키고 빨리 판독 될 샘플을 허용하는 다수의, 판독을 위해 셋업에서 간단 할 것이다. 여기에서 우리는 PCR 나는 기존의 실시간 사용하는 디지털 방울 분석의 판독을위한 간단한 방법을 설명nstrument은 액적 기반 디지털 분석의 대량 형광을 측정합니다. 새로운 방식은 디지털 PCR 분석법에 적용 할 수 있지만, (PCR 대해 우수한 결과를 수득)에 문제가있는 실시간 증폭 분석법을하는 아날로그 디지털 WGA 분석에 특히 유리하다. WGA 공통 서열, 길이 및 염기 함량 이질적 주형 분자와 시료에 적용된다. 이들 다른 템플릿 분자는 참조 ( &quot;표준&quot;) 특성과 일치하는 샘플의 사용을 필요로, 다른 비율 6에서 증폭된다. 종종, 이러한 표준을 사용할 수 없으며, 또는 수신 된 샘플의 특성을 알 수있다. 입력 질량, 분자의 입력 번호, 둘, 또는 둘의 조합 - WGA 화학의 입력 재료 및 길이 의존 속성 이질성은 26도 정량화되는 것에 모호성을 생성하여 결과 해석을 복잡. F어떤 시퀀스의 오염 물질 분자가 방해 가능성이 있기 때문에 inally, 시퀀스 비 특이도는 정량적 PCR보다 오염 양적 다중 변위 증폭 (MDA) 더 민감 렌더링합니다. 디지털 마이크로 유체 분석은 주형 분자를 편석 적은 오염물 샘플링되도록 반응 부피를 감소시킴으로써 오염을 해결. 여기서 우리는 인기있는 등온 WGA 방법, MDA (27)를 사용합니다. 참고로, PicoPlex 및 MALBAC (28)를 포함하여 여러 가지 다른 WGA 화학은 초기 등온 가닥 변위 단계에 결정적으로 의존한다. 등온 단계 정량적 WGA 아날로그 실시간 분석을 적용하는 과제를 악화. WGA는 어느 쪽도 완전히 설치 중에 방지하지 원치 않는 변수를 미리 증폭으로 이어지는 없으며, 이종 분자의 복제가 완료 구동 및 정지 할 수있는 방식으로 ( &quot;순환&quot;) 이산화 할 수 PCR (11) 등의 다음주기에 앞서 </suP&gt; (그림 1). WGA위한 디지털 분석법 포맷으로 인해 분석 종말점에서 열거 각 분자의 분리에 전형적인 반응 설정 절차를 수용합니다 원래 판독 정확성은 증폭 효율의 변화는 거의 독립적 것이다 수단 (그래서 사전 증폭은 결과에 영향을 미치지 않는다). 분석 종말점에서 액적마다 신호 레벨이 액적 체적에 의존하므로 분석은, 균일 한 양으로 오일 제조 방울에 따라, 우리는 결과의 일관성 액적 크기의 분포에 걸쳐 평균에 의존하지 않는다. 단 분산 방울을 만드는 것은 이제 (약 3,500 단 분산 방울 논문 2013 년 이후 출판 된) 표준 절차이지만, 마이크로 유체 기기 (25)를 필요로한다. 사실, 여섯 개 이상의 기업들은 방울의 생산에 의존하는 독립적 인 상용 제품을 개발하고, 방울 만들기 마이크로 유체 칩은23,29은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 연구를 위해, 우리는 사내 (프로토콜 참조) 생산 지정 미세 유체 장치를 사용했다. 주사기를 통해 유동 장치도 시판되고 구동 펌프, 그러나 대안으로, 비용을 줄이기 위해 30 진공 구동 흐름을위한 단일의 일회용 주사기로 치환 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Evagreen Dye</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B0269S</td>
			<td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>N3011S</td>
			<td>Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Randomized MDA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-NNNNN*N-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&#8217; and 5&#8217;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Nuclease-free water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR optical strip caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25uM each)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89003-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-rad oil for evagreen</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>186-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JumpStart Taq ReadyMix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2893-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

디지털 분석은 세포 및 희소 개별 핵산 분자의 계수의 검출을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나 디지털 분석은 일상적으로 인한 비용과 시중에서 판매하는 방법과 관련된 특정 장비에 적용되지 여전히. 여기서 우리는 액적 기반 디지털 벌크 분석법 형광을 측정하는 종래의 실시간 PCR 기기를 사용하여 디지털 액적 분석의 판독을 위해 단순화 된 방법을 제시한다. 우리는 합성 액적 혼합물 및 액적 디지털 다중 변위 증폭 (MDA) 분석을 이용하여 벌크 분석의 판독 성능을 특성화. 디지털 반응 형식에서 양적 MDA는 특히 이점, 그러나 우리의 새로운 방법은 모든 디지털 분석에 적용됩니다. 디지털 PCR 등의 설립 디지털 분석 프로토콜의 경우,이 방법은 속도와 분석 판독을 단순화하는 역할을한다. 우리 벌크 판독 partitione 방법론의 장점을 가져온다전문 판독 장비가 필요없이 D 분석. 이 표준에 대한 요구가 종래의 실시간 실험보다 덜 까다로운 있지만 벌크 판독 방법의 주된 제한, 액적 계산 플랫폼 및 표준 시료에 대한 필요성에 비해 동적 범위가 감소된다. 정량적 전체 게놈 증폭 (WGA)는 WGA 반응에서 오염물을 테스트하는 데 제약 품질 제어 및 우주 생물학 등 다양한 응용 분야에있어서 큰 가능성을 제공 미지 서열과 함께 DNA 단편의 존재를 검출하기위한 가장 민감한 방법이다.

종래의 벌크 / 실시간 정량적 PCR이 판독 및 WGA 정량 분석 (도 1) 모두에 사용될 수 있지만, 디지털 정량 분석은 이점이있다 (표 1)을 제공한다. 기재된 방법에서는 단순한 벌크 종료점 측정 (도 2)과 미세 액적 형태로 디지털 분석법을 판독. 이 방법은 광범위하게 적용 할 수 있지만이 방법은 기존의 실시간 분석을위한 특별한 도전을 제시하기 때문에, 우리는 양?...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.2K 조회수.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

연구

생물학

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

유해 자극 감지를 위한 양적 행동 판독으로 기획자 스크런싱

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

디지털 핵산 정량 분석 실험의 단순 대량 판독