Name: simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays at JoVE.com

The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

주 :이 프로토콜은 기존 상업용 방울 방울 결정자 23,29 형성 할 수있는 미세 유체 소자를 제작하는 단계, 상기 분석에 대한 필요가 없다. 1. 물방울 형성​​ 미세 유체 소자를 확인 <ol><li> SU-8 마스터 제조 프로토콜에 채널 마스터 주형을 제조 이전 31 약술하지만 방울 생성기 마스크 패턴 (32). </li><li> 소프트 리소그래피 (32, 33)의 기술을 이용하여 PDMS의 장치를 제작. </li></ol> 2. 대량 물방울 판독에 대한 반응 믹스를 준비 주 : 프로토콜은 증폭 반응의 다양한 형태를 사용하여 핵산을 정량하는데 사용될 수있다. 예로서, 몇몇 람다 DNA 농도 MDA 필요한 시약 주어진다. 시약 세부 사항은 특정 시약의 표에 나열되어 있습니다. 액적 내의 템플릿의 분포에 의존 sufficien시료의 t 혼합. <ol><li> 구하거나 Purify를 Phi29 DNA 중합 효소. <ol><li> 이전에 공급 업체로부터 7 또는 구매 한 바와 같이 Phi29를 정화. 도시 된 실험에 사용 Phi29 정제 하였다. </li></ol></li><li> 65 mM의 KOH, 1.65 mM의 EDTA, 14 mM의 DTT로 구성된 변성 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. </li><li> 65 mM의 염산, 0.21 M 트리스 (CL)의 pH 7.0, 9 mM 트리스 - CL 산도 8.0 구성된 중화 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. </li><li> 이러한 뉴 클레아없는 물과 같은 두 가지 기준, 하나없이 템플릿 컨트롤 (NTC), 하나의 높은 템플릿 농도 (4 페이지 주변 / μL 람다 DNA)를 준비합니다. qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL 각 표준의 3.3 μl를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 3.3 μL 각을 끄다. </li><li> qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL를 사용하여 원하는 템플릿의 3.3 μl를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 3.3 μL로 담금질중화 버퍼의. </li><li> 얼음에 샘플 당 마스터 혼합물의 11 μl를 준비합니다. 배 MDA 반응 마스터 혼합물이 2 배 이중 가닥의 DNA로 구성 (dsDNA) 결합 염료, 배 qPCR에 참조 염료, 50 μm의 무작위 올리고, 2 ㎎ / ㎖ BSA, 배 Phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 4.8 밀리미터의 dNTPs, 뉴 클레아없는 물 및 40 μg의 / ㎖ Phi29 DNA 폴리머 라제. 잘 7.5.Mix보다 산도 수준이 매우 높거나 낮은 발생하지 않는 중합 효소를 보장하기 위해 지난 Phi29 DNA 중합 효소를 추가합니다. </li><li> 옵션 : 적은 오탐 (false positive)의 경우, 이전에 방울 (34)을 형성하는 자외선을 마스터 믹스를 노출. <ol><li> 얼음에 0.5 ml의 1.5 ml의 명확한 튜브 샘플 당 예비 혼합물의 10 μl를 준비합니다. 사전 혼합은 55 μm의 무작위 올리고, 2.2 ㎎ / ㎖ BSA, 1.1 Phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 5.3 밀리미터의 dNTPs, 및 뉴 클레아없는 물로 구성되어 있습니다. </li><li> (34) 기술로 얼음에 물에 튜브를 삽입하고 ACCU에 자외선 (254 nm의)에 노출5.7 J의 mulated 용량 / ㎠. </li><li> 사전 혼합물에 40 ㎍ / ml의 dsDNA 결합 배로 염료, 배로 참조 염료 및 Phi29를 추가합니다. 잘 섞는다. </li></ol></li><li> 변성 템플릿 또는 표준의 10 μL 마스터 혼합물의 10 μl를 결합합니다. 잘 섞는다. </li></ol> 3. 물방울 형성 참고 : 물방울 정전기 및 전단 응력에 매우 민감 할 수 있습니다. 정전기가 발생할 수 있습니다 옷을 제거하고 방울을 형성하기 전에 자신을 접지. 최대한 에멀젼에서, 튜브의 상부에서 튜브의 유제를 처리. 피펫 에멀젼 매우 느리게, 바람직하게는 넓은 구멍 피펫 팁과. 피펫 팁으로부터 송출되면, 피펫 속도를 결정하는 팁의 측면에 에멀젼 시계. <ol><li> 양식 방울. 실험은 도시의 경우, 마이크로 유체 장치는 오일 유입구와 방울을 생성하기위한 유동 포커싱 접합 두 수용액 유입구를 갖는다. 두 syri를 사용하여NGE 20,000 NL 1 방울을 생성하기 위해 마이크로 유체 칩을 통해 오일의 계면 활성제 및 55 μL의 반응 혼합물을 20 μL의 유량을 제어하는​​ 펌프. </li><li> 이것은 계면 활성제 많은 오일 소적을 함께 제조 할 수 있지만, 조성물은 매우 높은 온도에서 및 시간에 걸쳐 방울의 안정성에 영향을주는 것 : 참고. 하나의 가능한 조합은 음이온 성 계면 활성제와 19,35 불소화 오일 HFE 7500이다. </li><li> 임의의 방법 13,36 어떠한 크기로 액적들을 생성하지만, 액적 인구 크기 변동은 벌크 형광, 따라서 분석의 정확성에 영향을 미칠 것이다. 도시 된 실험에서, NL 1 방울의 양을 가진 단 분산했다. </li><li> PCR 튜브에 물방울과 오일을 모두 수집합니다. 각 샘플에 대해, 나누어지는 30 광학 모자와 신선한 PCR 튜브에 오일 μL, 오일 위에 방울의 20 μl를 전송합니다. 일관된 볼륨은 분석이 교류로인지 확인가능한 보좌 신부. </li><li> 닫기 튜브는 느슨한 모자는 오일이 증발 할 수로, 단단히 모자. </li></ol> 4. 등온 증폭 <ol><li> PCR 용 열 순환기, qPCR에의 열 순환기, 또는 핫 플레이트를 이용하여, 7 시간 동안 30 ° C에서 샘플들을 배양하고, 75 ℃에서 1 분 동안 불 활성화. 방울의 튜브는이 시점에서 몇 시간 동안 호일로 덮여 냉장고에 남아있을 수있다. </li></ol> 5. 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 즉시 qPCR에의 열 순환기를 이용하여 모든 샘플에 대해 형광 염료 농도를 측정하고, 반응을 불활 다음. 최적의 필터 설정은 염료의 여기 및 방출 스펙트럼에 의존 할 것이다. 예를 들어, dsDNA 염료 - 결합에 대해 설정 492 내지 516 nm의 필터 및 기준 염료에 대해 설정 585 내지 610 nm의 필터를 사용한다. 다른 형광 측정 기술은 형광을 정량하는 데 사용될 수있다. </li><li> 각 샘플에 대해,에 의해 결합 dsDNA 염료의 형광 강도를 분할기준 염료의 형광 강도. 모든 시료에서 배경 형광, 또는 아니 템플릿 제어 정규화 형광을 뺀다. </li><li> 표준에서 수정 된 형광 측정을 사용하여 선형 표준 곡선을 작성합니다. NTC 표준은 0 % 형광 방울과 샘플에 대한 형광 ( &quot;모든 부정&quot;)를 나타내며, 높은 템플릿 농도 형광 측정은 100 % 형광 방울과 샘플에 대한 기대 형광 ( &quot;모든 긍정적&quot;)입니다. 대응하는 표준 곡선을 사용하여, 그들의 대량의 형광에 기초하여 양 및 음의 액적 중간 비율을 예측한다. </li></ol> 6. 일으키기 방울 원리 증명 측정을위한 <ol><li> 형광 (포지티브) 방울을 0.1 ng를 람다 DNA, 1X dsDNA 결합 염료, 1X 기준 염료, 1.5 유닛의 Taq DNA 중합 효소, 10 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의 KCl을, 1.5 m 이루어진 PCR 반응 혼합물을 제조M의 MgCl 2, 0.2 밀리미터의 dNTP, 0.5 μM 프라이머. 전술 한 바와 같이 혼합물을 30 회 (20 초, 20 초, 1 분, 72 ° C, 55 ° C, 95 ° C) 열 순환 후 액 적을 형성한다. </li><li> 비 형광 (네거티브) 방울을 : 1X dsDNA 결합 염료 이루어진 PCR 반응 혼합물을 제조, 1X 기준 염료, 1.5 유닛의 Taq DNA 중합 효소, 10 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 0.2 mM의 dNTP를, 0.5 μm의 프라이머. 혼합물을 30 회 (20 초 동안 95 ° C, 20 초, 1 분, 72 ° C, 55 ° C)를 선택한 다음, 열 순환 액 적을 형성한다. </li><li> 미리 혼합 비율 액적 형성 <ol><li> qPCR에 튜브에 불소 오일의 20 μl를 배포, 증발을 방지 할 수있는 광학 캡 커버. </li><li> 오일의 상단에 부정적인 비율 : 부드럽게 원하는 양에 잘 혼합 된 방울의 10 μl를 피펫. 의 결과에 긍정적 인 : 음 방울 비율은 1 (모든 긍정적 인), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0 (모든 NEG했다극상). </li></ol></li><li> qPCR에의 열 순환기를 사용하여 모든 샘플에 대한 형광 염료 농도를 측정한다. 이 프로토콜의 경우, 결합 dsDNA 염료에 대해 설정 492 내지 516 nm의 필터 및 기준 염료에 대해 설정 585 내지 610 nm의 필터를 사용한다. <ol><li> dsDNA가 기준 형광 염료를 사용한 형광 염료 결합 정상화. 또한 &quot;모든 긍정적&quot;샘플의 형광으로 정상화. </li></ol></li><li> &quot;모든 긍정적&quot;과 &quot;모든 부정&quot;샘플에서 정규화 된 형광 측정을 사용하여 선형 표준 곡선을 작성합니다. 대응하는 표준 곡선을 사용하여, 그들의 대량의 형광에 기초하여 양 및 음의 액적 중간 비율을 예측한다. </li><li> 각각의 비율 (N = 3) 독립 방울 형성​​하고 각 복제에 대한 믹싱에 대한 실험을 반복합니다. </li></ol> 7. 원리 증명 MDA 실험 <ol><li> 사양과 람다 DNA 원액의 농도를 측정trophotometer. <ol><li> 물방울 당 평균 10 템​​플릿 분자에 필요한 템플릿 농도를 계산한다. 이 프로토콜의 경우, 방울 볼륨이 1 NL과 람다 DNA의 1 NG가 약 1.9 × 10 (7) 사본이 포함되어 있다고 가정. 따라서, 방울 당 10 템​​플릿은 NL 당 10 사본 또는 μL 당 526 FG 람다 DNA를 될 것입니다. 방울이 형성 될 때 주형 따라서 높은 초기 주형 농도 / μL 3.2 PG 것이다, ~ 6 배 희석한다. </li></ol></li><li> 직렬 변성 버퍼와 같은 부피의 중화 버퍼와 3.2 PG / μL로 람다 DNA를 희석. 0.1의 희석 배수를 들어, 변성 완충액 45 μl를 10 μl의 샘플을 조합하고 3 분 동안 RT에서 배양한다. 중화 버퍼의 45 LL은 해소에 추가. </li><li> 실험 샘플의 나머지 부분을 만드는 단계 7.2에 기재된 바와 같이, 상기 샘플을 희석한다. 표시되는 반응에서 초기 템플릿 농도는 3.2 페이지, 320 FG했다160 FG, 32 FG, 16 FG, 3.2 FG 및 마이크로 리터 당 1.6 FG. 참고 : mastermix 추가 후 최종 템플릿 농도는 526 FG했다, 52.6 FG, 26.3 FG, 5.26 FG, 마이크로 리터 당 2.63 FG, 526 AG, 263 AG. 방울 당 각각 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 예상 람다 사본. </li><li> 생성 및 단계 2.5-5.3에 설명 된대로 각 샘플에서 방울을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 디지털 카메라를 사용하여 도시 된 형광 영상 (도 2,3) RT에서 10 배의 대물 렌즈와 에피 형광 현미경에 장착 획득. 각 샘플에 대한보기의 열두 필드를 취득. 형광 슬라이드로 얻은 배경 이미지로 수정 형광 이미지. </li><li> 유화 오일이 빨리 증발로 영상 37 포함 된 실을 사용합니다. </li><li> ImageJ에 매크로 (보조 기호 파일)를 사용하여 개별 방울 강도를 분석합니다. <ol><li> 가장 N 비 형광 액 적을 분리 임계 형광 강도를 선택높은 템플릿 농도 이미지의 형광 방울에서 TC 이미지. 각각의 미지 시료에 대하여, 임계치 이상의 형광 강도와 방울의 비율을 계산한다. </li></ol></li></ol> 8. PCR 및 MDA 벌크 반응 <ol><li> PCR 반응을 준비합니다. <ol><li> 직렬 0.1 희석 배수와 템플리트 DNA를 희석. 각각의 희석, 변성 버퍼의 45 μL와 템플릿의 10 μl를 결합하고 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 45 μL로 희석을 결합합니다. </li><li> 샘플 당 PCR의 mastermix 20 μl를 준비합니다. 1.1 PCR 반응 마스터 혼합물의 Taq DNA 중합 효소 μL 60 대 / 11 mM 트리스 - 염산, 55mM의 KCl, 1.65 밀리미터의 MgCl 2, 0.22 밀리미터의 dNTP 구성, 1.1 염료, 1.1 참조 염료, 550 nm의 dsDNA 결합 각각의 프라이머. </li><li> 희석 템플릿의 2 μL 및 mastermix 20 μl를 결합합니다. 참고 : 최종 템플릿 농도 T에그는 도시 반응을 PCR 50 페이지, 5 페이지, 500 FG, 마이크로 리터 당 50 FG, 5 FG, 500 AG 및 0g 람다 DNA했고, 세중의에서 수행되었다. </li><li> 다음 프로그램 qPCR에 기계의 열 순환 PCR 반응. 2 분 동안 72 ℃에서 2 분 전에 30 초, 30 초, 20 초 동안 57 ° C, 72 ° C ~ 95 ° C의 40주기를 실행하고 4 ℃에서 유지. </li><li> dsDNA는 참고 염료 형광 이전에 추가 분석을 이용하여 염료 형광 결합 정상화. </li></ol></li><li> MDA 반응을 준비합니다. <ol><li> 단계 8.1.1에 설명 된대로 샘플을 희석. </li><li> 얼음에 샘플 당 마스터 혼합물의 11 μl를 준비합니다. 배 MDA 반응 마스터 혼합물 배 dsDNA 결합 염료, 배 기준 염료, 50 μm의 무작위 올리고, 구성 2 ㎎ / ㎖ BSA, 배 phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 4.8 밀리미터의 dNTPs, 뉴 클레아없는 물, 40 ㎍ / ㎖의 Phi29 DNA 중합 효소. </li><li> 40 μg의에 Phi29 DNA 중합 효소를 추가 / 중합 효소 개발을 위해 지난 ㎖로OES 7.5 이상의 pH 값이 더 높거나 낮을 발생하지. 잘 섞는다. </li><li> qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL로 희석 템플릿의 3.3 μL를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 3.3 μl를 추가합니다. </li><li> 변성 템플릿의 10 μL 마스터 혼합물의 10 μl를 결합합니다. 잘 섞는다. </li><li> 다음 프로그램 qPCR에 기계에서 MDA 반응을 실행합니다. </li><li> 형광마다 7.5 분을 측정, 4 시간 동안 30 ° C에서 잡으십시오. </li><li> 1 분 동안 75 ℃에서 비활성화. </li><li> dsDNA가 기준 형광 염료를 사용한 형광 염료 결합 정상화. 또한, 각 샘플의 최대 형광 의해 정상화. </li></ol></li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+detection+of+single-nucleotide+and+copy-number+variations+of+a+single+human+cell.">Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Abate, A. R., Weitz, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. 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Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

디지털 분석법 희귀 세포의 검출 및 핵산 분자의 개인의 계산을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나, 디지털 분석은 여전히​​ 통상적으로 시판되는 방법과 관련된 특수 장비의 비용을 부분적으로 분석 실험실에서 기인인가되지 않는다. 여기서 우리는 표준 정량 실시간 PCR 기계를 사용하여 단순화 된 아날로그 판독하여 핵산을 정량 종점 디지털 분석법을 설명한다. 이 방법은 설정 신속하고, 판?...

핵산 정량 (디지털 PCR) 1-4 및 기본 순서 (서열)에 대한 디지털 분석은 강하게 생명 과학 및 의학에 영향을하고 있습니다. 디지털 분석은, 높은 감도를 제공하는 실험을 통해 용이 한 비교를 가능하게하고, 결정적으로, 비교 데이터 (5) (표 1)을 함유하는 큰 데이터베이스의 구성을 가능하게 절대치 스케일 (제어에 대해 생략)에 분자 계수의 정량화를 제공한다. 지난 15 년 동안, 전체 게놈 증폭 (WGA)은 핵산 증폭 용 PCR 일반 공구로 나란히 나타났다. PCR 원한다면, WGA는 용이하게 검출 또는 염기 서열 분석 등 후속 분석을 위해 사용할 수있는 레벨까지 분 샘플을 증폭 소자에 의해 분석하고 예비 애플리케이션에 유용하다. PCR 달리 WGA 오히려 미지 서열을 포함한 시료 중의 모든 서열의 증폭을 허용하는, 특정 DNA 유전자좌에 특이하지 않다.PCR 및 WGA 간의 기본적인 차이점은 서로 상보 만드는 방법 및 그 응용이 다른 과제가 발생한다. WGA 반응 (6)의 높은 수율은 단일 분자 (7), 단일 세포 (8) 및 정량 또는 추가 분석을 위해 다른 낮은 바이오 매스 샘플 9에서 게놈 DNA의 일상적인 증폭을 할 수 있습니다. WGA 화학와 관련된 주요 문제는 오염 물질에 극단적 인 감도와 개별 템플릿 분자 (6)에 걸쳐 고르지 증폭 있습니다. 단일 셀 시퀀싱 그러나 WGA는 얻고 인기가 WGA에 의해 WGA 기술 (10), 및 템플릿 정량의 &#39;킬러 애플리케이션&#39;로 떠오르고있다하는 응용 프로그램 (7)의 많은 분야에서 중요하다. 디지털 핵산 정량 계측 이전 판막과 미세 유체 valveless 견적 다양한 설명되었지만액적 기반 분석법을 포함한 TS 11-14, 15, 16 (표 2). 그러나 디지털 분석을위한 상업 미세 유체 시스템은 반응 설치 및 제품 감지 (17)에 대한 전문적인 장비를 필요로한다. 사용자 정의 판막 미세 유체는 유연하지만, 정밀 미세 가공 및 공압 제어 시스템 (18)을 필요로한다. 이 에멀젼 계 디지털 분석법 19,20 용 단 분산 미세 방울을 만드는 비교적 간단하지만, 디지털 판독 대규모 와이드 필드 영상 중 하나를 요구하는 (인기있는 차세대 시퀀싱 기술과 유사) 기술적 부담이다 (21, 22) 또는 고속 액적 검출 23-25 ​​흐름 기반. 이상적으로, 디지털 분석은 복잡한 장비에 대한 필요성을 감소시키고 빨리 판독 될 샘플을 허용하는 다수의, 판독을 위해 셋업에서 간단 할 것이다. 여기에서 우리는 PCR 나는 기존의 실시간 사용하는 디지털 방울 분석의 판독을위한 간단한 방법을 설명nstrument은 액적 기반 디지털 분석의 대량 형광을 측정합니다. 새로운 방식은 디지털 PCR 분석법에 적용 할 수 있지만, (PCR 대해 우수한 결과를 수득)에 문제가있는 실시간 증폭 분석법을하는 아날로그 디지털 WGA 분석에 특히 유리하다. WGA 공통 서열, 길이 및 염기 함량 이질적 주형 분자와 시료에 적용된다. 이들 다른 템플릿 분자는 참조 ( &quot;표준&quot;) 특성과 일치하는 샘플의 사용을 필요로, 다른 비율 6에서 증폭된다. 종종, 이러한 표준을 사용할 수 없으며, 또는 수신 된 샘플의 특성을 알 수있다. 입력 질량, 분자의 입력 번호, 둘, 또는 둘의 조합 - WGA 화학의 입력 재료 및 길이 의존 속성 이질성은 26도 정량화되는 것에 모호성을 생성하여 결과 해석을 복잡. F어떤 시퀀스의 오염 물질 분자가 방해 가능성이 있기 때문에 inally, 시퀀스 비 특이도는 정량적 PCR보다 오염 양적 다중 변위 증폭 (MDA) 더 민감 렌더링합니다. 디지털 마이크로 유체 분석은 주형 분자를 편석 적은 오염물 샘플링되도록 반응 부피를 감소시킴으로써 오염을 해결. 여기서 우리는 인기있는 등온 WGA 방법, MDA (27)를 사용합니다. 참고로, PicoPlex 및 MALBAC (28)를 포함하여 여러 가지 다른 WGA 화학은 초기 등온 가닥 변위 단계에 결정적으로 의존한다. 등온 단계 정량적 WGA 아날로그 실시간 분석을 적용하는 과제를 악화. WGA는 어느 쪽도 완전히 설치 중에 방지하지 원치 않는 변수를 미리 증폭으로 이어지는 없으며, 이종 분자의 복제가 완료 구동 및 정지 할 수있는 방식으로 ( &quot;순환&quot;) 이산화 할 수 PCR (11) 등의 다음주기에 앞서 </suP&gt; (그림 1). WGA위한 디지털 분석법 포맷으로 인해 분석 종말점에서 열거 각 분자의 분리에 전형적인 반응 설정 절차를 수용합니다 원래 판독 정확성은 증폭 효율의 변화는 거의 독립적 것이다 수단 (그래서 사전 증폭은 결과에 영향을 미치지 않는다). 분석 종말점에서 액적마다 신호 레벨이 액적 체적에 의존하므로 분석은, 균일 한 양으로 오일 제조 방울에 따라, 우리는 결과의 일관성 액적 크기의 분포에 걸쳐 평균에 의존하지 않는다. 단 분산 방울을 만드는 것은 이제 (약 3,500 단 분산 방울 논문 2013 년 이후 출판 된) 표준 절차이지만, 마이크로 유체 기기 (25)를 필요로한다. 사실, 여섯 개 이상의 기업들은 방울의 생산에 의존하는 독립적 인 상용 제품을 개발하고, 방울 만들기 마이크로 유체 칩은23,29은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 연구를 위해, 우리는 사내 (프로토콜 참조) 생산 지정 미세 유체 장치를 사용했다. 주사기를 통해 유동 장치도 시판되고 구동 펌프, 그러나 대안으로, 비용을 줄이기 위해 30 진공 구동 흐름을위한 단일의 일회용 주사기로 치환 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Dye</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>Heated to 50 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C and quenched on ice prior to dilution</td></tr><tr><td>Randomized MDA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-NNNNN*N-3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&amp;rsquo; and 5&amp;rsquo;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>UltraPure Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)</td></tr><tr><td>ROX reference dye</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR optical strip caps</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (25 micromolar each)</td><td>Agilent Technologies</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Barrier pipette tips</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad oil for evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

디지털 분석은 세포 및 희소 개별 핵산 분자의 계수의 검출을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나 디지털 분석은 일상적으로 인한 비용과 시중에서 판매하는 방법과 관련된 특정 장비에 적용되지 여전히. 여기서 우리는 액적 기반 디지털 벌크 분석법 형광을 측정하는 종래의 실시간 PCR 기기를 사용하여 디지털 액적 분석의 판독을 위해 단순화 된 방법을 제시한다. 우리는 합성 액적 혼합물 및 액적 디지털 다중 변위 증폭 (MDA) 분석을 이용하여 벌크 분석의 판독 성능을 특성화. 디지털 반응 형식에서 양적 MDA는 특히 이점, 그러나 우리의 새로운 방법은 모든 디지털 분석에 적용됩니다. 디지털 PCR 등의 설립 디지털 분석 프로토콜의 경우,이 방법은 속도와 분석 판독을 단순화하는 역할을한다. 우리 벌크 판독 partitione 방법론의 장점을 가져온다전문 판독 장비가 필요없이 D 분석. 이 표준에 대한 요구가 종래의 실시간 실험보다 덜 까다로운 있지만 벌크 판독 방법의 주된 제한, 액적 계산 플랫폼 및 표준 시료에 대한 필요성에 비해 동적 범위가 감소된다. 정량적 전체 게놈 증폭 (WGA)는 WGA 반응에서 오염물을 테스트하는 데 제약 품질 제어 및 우주 생물학 등 다양한 응용 분야에있어서 큰 가능성을 제공 미지 서열과 함께 DNA 단편의 존재를 검출하기위한 가장 민감한 방법이다.

종래의 벌크 / 실시간 정량적 PCR이 판독 및 WGA 정량 분석 (도 1) 모두에 사용될 수 있지만, 디지털 정량 분석은 이점이있다 (표 1)을 제공한다. 기재된 방법에서는 단순한 벌크 종료점 측정 (도 2)과 미세 액적 형태로 디지털 분석법을 판독. 이 방법은 광범위하게 적용 할 수 있지만이 방법은 기존의 실시간 분석을위한 특별한 도전을 제시하기 때문에, 우리는 양?...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.2K 조회수.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in potentially heterogeneous specimens. Nucleic acids can be detected via several established approaches, including analytical methods that are spectrophotometric (e.g., A260), fluorometric (e.g., binding of fluorescent dyes), or colorimetric (nucleoside-specific chromogenic chemical reactions).1 Though it cannot readily distinguish RNA from DNA, the A260/A280 ratio is commonly employed, as it offers a simple and rapid2 assessment of the relative content of nucleic acid, which absorbs predominantly near 260 nm and protein, which absorbs primarily near 280 nm. Ratios &lt; 0.8 are taken as indicative of 'pure' protein specimens, while pure nucleic acid (NA) is characterized by ratios &gt; 1.53.
However, there are scenarios in which the protein/NA content cannot be as clearly or reliably inferred from simple uv-vis spectrophotometric measurements. For instance, (i) samples may contain one or more proteins which are relatively devoid of the aromatic amino acids responsible for absorption at &asymp;280 nm (Trp, Tyr, Phe), as is the case with some small RNA-binding proteins, and (ii) samples can exhibit intermediate A260/A280 ratios (~0.8 &lt; ~1.5), where the protein/NA content is far less clear and may even reflect some high-affinity association between the protein and NA components. For such scenarios, we describe herein a suite of colorimetric assays to rapidly distinguish RNA, DNA, and reducing sugars in a potentially mixed sample of biomolecules. The methods rely on the differential sensitivity of pentoses and other carbohydrates to Benedict's, Bial's (orcinol), and Dische's (diphenylamine) reagents; the streamlined protocols can be completed in a matter of minutes, without any additional steps of having to isolate the components. The assays can be performed in parallel to differentiate between RNA and DNA, as well as indicate the presence of free reducing sugars such as glucose, fructose, and ribose (Figure 1).

A suite of colorimetric assays is described for rapidly distinguishing protein, RNA, DNA, and reducing sugars in potentially heterogeneous biomolecular samples.

신속한 Colorimetric Assays는 질적 Biomolecular 샘플에서 RNA와 DNA를 구별 할

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

연구

화학

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

유전학

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

생체공학

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

생물학

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

의학

<meta charset="utf8"></head><body>디지털 액적 PCR을 사용한 바이러스 게놈 정량을 위한 표준화된 프로토콜

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of AAV genome copy number in vector preparations is essential for bioprocess optimization and dosage calculation in both preclinical and clinical studies of AAV-based gene therapy products. Currently, a consensus protocol for AAV viral genome titration is lacking. Here, we present a digital droplet PCR (dd_PCR) protocol for the quantification of viral genomes in purified vector samples. Samples are treated with DNase I to eliminate unpackaged contaminant DNA. DNase-treated samples are then mixed with an appropriate primer-probe set (designed according to the target AAV genome) and PCR reagents, and then loaded into a droplet generator. The prepared droplets are transferred into a PCR plate, where PCR amplification is performed and analyzed. The viral genome titer is calculated based on the concentration (copies/&#181;L), accounting for sample dilutions. A successful measurement shows a clear separation of the positive and negative droplet clouds, has at least 10,000 accepted droplets, shows a value between 10 copies/&#181;L and 10,000 copies/&#181;L, and has a coefficient of variation (CV) between repeats lower than 20%. Reliable viral genome titration will aid in the development of safe and effective AAV-based gene therapy products.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 정확한 아데노 관련 바이러스 게놈 정량을 위한 디지털 액적 PCR 방법 최적화

Precise quantification of adeno-associated virus (AAV) vector genome copies is critical, but a standardized protocol has yet to be established. This protocol describes a validated method for preparing purified AAV samples and conducting digital droplet polymerase chain reaction (dd_PCR) to reliably quantify the viral genome titer.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 water-in-oil droplets, and the PCR occurs in the individual droplets. The dd-PCR has several advantages over conventional real-time qPCR, including increased accuracy in detecting low-abundance targets, omitting reference genes for quantification, eliminating technical replicates for samples, and showing high resilience to inhibitors in the samples. Recently, dd-PCR has become one of the most popular methods for accurately quantifying target DNA or RNA for gene expression analysis and diagnostics. Circular RNAs (circRNAs) are a large family of recently discovered covalently closed RNA molecules lacking 5' and 3' ends. They have been shown to regulate gene expression by acting as sponges for RNA-binding proteins and microRNAs. Furthermore, circRNAs are secreted into body fluids, and their resistance to exonucleases makes them serve as biomarkers for disease diagnosis. This article aims to show how to perform divergent primer design, RNA extraction, cDNA synthesis, and dd-PCR analysis to accurately quantify specific circular RNA (circRNA) levels in cells. In conclusion, we demonstrate the precise quantification of circRNAs using dd-PCR.

This protocol describes the detailed method of digital droplet PCR (dd-PCR) for precise quantification of circular RNA (circRNA) levels in cells using divergent primers.

디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

디지털 핵산 정량 분석 실험의 단순 대량 판독

요약

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이 비디오의 챕터

신속한 Colorimetric Assays는 질적 Biomolecular 샘플에서 RNA와 DNA를 구별 할

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

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신속한 Colorimetric Assays는 질적 Biomolecular 샘플에서 RNA와 DNA를 구별 할

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

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