나는 그림에서 사진 박사 제니퍼 컬티스 감사하고 싶습니다. 1 제레미 페이건와 비판적 원고를 읽기위한 박사 피렌체 말로. 우리 작품은 NIH 부여 1R01GM088202에 의해 지원됩니다.

1. 머리를 절개를 플라이 <ol><li> 당신은 (젤라틴 코팅 슬라이드 포함) 핸드에있는 모든 자료를 가지고 있는지 확인하십시오. 글루 타 알데히드와 오스뮴의 fixatives (아래 참조) 준비합니다. 얼음 1.5 ML 튜브에서 나누어지는 200μl 글루 타 알데히드 해결책을 포함하는 유전자형 당. </li><li> CO 2 패드 (우리는 보통 머리가 절차를 수행하는 동안 파괴하는 경우에 유전자형 최대 6를 포함 일곱 플라이 머리를 해부하다)에 파리를 마취. </li><li> 잡고 약간 핀셋과 함께, 최대 비행, 등의 측면의 흉부를 눌러 머리를 잘라하는 날카로운 메스를 사용합니다. </li><li> 핀셋으로 목을 만져 파리 머리를 고정하고 조심스럽게 눈 하나의 작은 부분을 슬라이스. 이것은 정착액의 침투를 (여러분이 clonal 분석을 위해 눈 섹션을 사용하려는 경우에는 이하 클론로 눈을 컷) 높여줍니다. 감동 나중에 sectioned 될 그대로 눈에 손상을 피한다. </li><li> 눈에서 절단 표면에 핀셋이나 메스로 머리를 만지 (정착액 위에 떠 자주 머리) 얼음 글루 타 알데히드 / 인산염 정착액에 머리를 전송 해부 머리가 이상에 대한 글루 타 알데히드 수정에 보관하지 말아야 오스뮴의 추가하기 전에 십오분 이상. 동일한 유전자형의 다른 파리와 같이 1.2-1.5를 반복합니다. </li></ol> 2. 고정 및 삽입 (모든 단계 장갑을 사용!) <ol><li> 10,000 RPM에서 1 분 Eppendorf의 원심 분리기에서 flyheads를 스핀. 머리 싱크대하지 않은 경우에도 계속합니다. </li><li> 오소 네 솔루션의 200μl를 추가하고 적어도 30 분 얼음에 1 시간 동안 수정. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 글루 타 알데히드 / 오스뮴 솔루션 (적절한 폐기물 처리 절차를 사용해야합니다!) 제거하고 200μl 오스뮴 솔루션으로 대체합니다. 1-6 시간을위한 얼음에 품어. 항상 머리가 완전히 액체 덮여되도록하고 머리 또는 눈을 붕괴 수로 솔루션을 모두 제거 절대! </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여, 정착액 폐기 (에탄올 지금 오스뮴가 포함되어 있으므로 적절한 폐기물 처리 절차를 사용해야합니다!) 얼음에 적어도 5 분 동안 0.5 - 1ml 30 % 에탄올과 부화를 추가합니다. </li><li> 50 %, 70 %, (80 %), 90 % 및 두 번 100 % 에탄올로 위의 단계를 반복합니다. 전자 현미경 분석을 위해 눈을 사용하는 경우 80 % 에탄올 단계를 포함합니다. 70 % 세척 단계 후, 샘플은 얼음에서 제거할 수 있습니다. </li><li> 프로필렌 산화물 (휘발성, 후드에서 계속 작동)의 동일한 볼륨으로 에탄올을 대체합니다. 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> 프로필렌 산화물 세척을 반복합니다. 프로필렌 산화물의 증발로 인해 눈이 중첩 피하기 위해 병렬로 여러 genotypes를 처리하는 경우 일괄 처리 작업. </li><li> , 프로필렌 산화물의 대부분 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 제거를 1:1 수지 500μl에 대한 추가 프로필렌 산화물 솔루션입니다. 실온에서 하룻밤 평형. </li></ol> 3. 금형에 삽입하고 배치 <ol><li> 모든 금형가 다른 genotypes를 추적하기 위해 표시되었는지 확인 후, 100 % 수지와 금형을 입력합니다. 너무 많이 넣다가 (금형의 표면 위에 아니오 &#39;하이 힐스&#39;똑바로 금형 표면에 걸쳐보고)하지 마십시오. EM 분석을위한 하드 수지를 사용하십시오. </li><li> 전송 피펫을 사용하면, 머리에서 50 %의 수지를 제거 100 % 수지로 대체하고, 실온에서 3-4시간을위한 부화. 머리가 수지로 가득 차 있으므로, 그들은 튜브의 바닥에 싱크 것입니다. </li><li> 작은 갈고리를 만들 수 번 하드 표면에 공격을 받았습니다 이쑤시개를 사용하여 주형으로 한 번에 하나의 머리를 전송합니다. </li><li> 수지 유출 대조를 보호하기 위해 귀하의 해부 범위의 작업 영역을 플레이스 알루미늄 호일. </li><li> 해부 바늘을 사용하여 수지의 머리 약간 범위, 소용돌이 불구하고보고 신중하게 가까운 지적 끝에 금형의 하단으로 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 눈 접선 표면이 약 절반 머리 계속해야하고, 금형의 전면 벽에있는 그대로 (!) 눈 (또는 교차 섹션을 원한다면 당신의 미래 sectioning 비행기) 목의 표면을 아래로 정렬 멀리 금형 벽에서 직경. 드문 경우에, 눈 표면과 머리 표피 사이의 빈 공간으로 볼 수있는 눈 붕괴. 당신이 붕괴 눈이있다면, 7 일 여분의 눈으로 그것을 대체합니다. </li><li> 모든 머리로 반복합니다. 일단 모든 정렬을 끝내고, 당신이 수지의 바늘을 제거하면 그들의 행동하지 않는지 확인하려고 모든 눈을 다시 확인합니다. </li><li> 당신이 해부 바늘을 제거할 때 눈에 이동에 문제가있을 경우, 원하는대로 눈을 위치를 신속하게 약간 떨어져 머리에서 바늘을 접어야 다음 천천히 완전히 바늘을 제거합니다. </li><li> 70 밤새 금형을 구워 ° C. </li></ol> 4. 트리밍과 sectioning <ol><li> K, 금형을 절곡하여 금형에서 강화된 블록을 제거합니다블록에 해당하는 eeping 추적하는 유전자형 (작은 섬광 튜브 안에 저장 예). </li><li> 트리밍 들어, 플렉시 또는 알루미늄 블록에 얼굴을 탑재하여 마이크로톰에 맞는 척을 사용합니다. 척에서 트리밍하는 블록 최대 눈을 탑재합니다. </li><li> 테플론 코팅 면도기를 사용하여 절개 범위가 베이드에서 신중하게 차단만을 상위 레이어를 잘라. 이것은 &#39;눈&#39;을 볼 수 있으므로 sectioning의 미래 비행기를 예측할 수있는지만 깨끗한 표면을 떠날 것입니다. 손가락을 절단하지 마십시오! </li><li> 머리 주위의 플라스틱의 대부분은 잘라 때까지 (눈을 정렬 때 금형의 상단이었던 예) 머리의 양쪽과 전면에 여분의 플라스틱을 잘라. 천천히 플라스틱의 여러 얇은 레이어를 잘라하여 머리를 접근하는 것이 좋습니다. </li><li> 깨끗한 면도날을 사용하여 신중하게 나중에 섹션 (보통 tangentially 눈에, 원래 금형 표면에 약간의 각도)하고자하는 정확한 비행기의 눈 위로부터 얇은 레이어를 제거합니다. </li><li> 방금 눈 바깥 표면을 떼어 버리기 시작 전까지 계속합니다. 당신이 마이크로톰 쉽게에 정렬하게 빛나는 투명한 표면을 얻기 위해 블레이드의 깨끗한 영역을 사용했는지 확인하십시오. </li><li> 면도날에 저장하려면 블록의 양쪽 주변 트리밍 원유에 대한 기존의 블레이드를 사용하여 고급 (첫 번째 절단 및 4.6) 트리밍을위한 새로운 블레이드를 사용합니다. 결국 당신은 미래의 섹션 비행기에 해당하는 약간 기울어져, 컷 - 오프 최고로 세 일방적인 피라미드됩니다. </li><li> 마이크로톰에서 블록을 탑재합니다. 실제 sectioning는 마이크로톰의 유형에 따라 다를 수 있으며 여기에 자세히 설명되지 않습니다. 우리는 0.5 1μm 섹션을 절단하기 위해 조직을 품질 다이아몬드 나이프로 Sorvall MT5000을 사용합니다. 가벼운 현미경 분석을 위해, 섹션 두께에 약간의 차이가 중요하지 않습니다. sectioning 클론은 화이트 + transgene 섹션으로 표시된 경우에는 1μm 섹션은 섹션 당 rhabdomeres (그림 2)에 인접한만큼 안료 과립을 가지고 있도록합니다. </li><li> 섹션 물 위에 떠 있습니다. 회전 운동에서 수면 아래에서 목조 Q - 팁의 평평 엔드와 첫번째 20-30 섹션을 허용하고 젤라틴 코팅 유리 슬라이드 (약 100 ° C에서 가열 접시에 보관에 물 한 방울로 그들을 전송 ). </li><li> 또 20-30 섹션과 반복합니다. 물이 증발하고 섹션을 슬라이드에 집중 때까지 기다리십시오. 보통 3 눈 부분 한 슬라이드에 잘 맞지 타운쉽 행에 의해 3 개 항목 (세명 눈) (상단 / 하단 부분)에 배치. </li></ol> 5. 얼룩과 미세 분석 <ol><li> 않는 sectioning 클론, 얼룩 섹션. 90에서 설정 난방 블록에 대한 섹션 플레이스 슬라이드 ° C. 슬라이드에 0.22μm 필터에 부착된 30 ML의 주사기에서 Toluidine - 푸른 얼룩 솔루션을 분배하고 10 초 동안 얼룩. 즉시 증류수를 폭 린스. 공기가 건조. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 슬라이드에 미디어를 장착 DPX 3 방울을 배포하고 coverslip로 커버. 3 천과 위로와 장착 매체 강화를 (룸 온도 예 : 하루)하자. </li><li> 가벼운 현미경 이미지. 좋은 섹션을 찾은 후 상세한 분석과 사진 촬영을위한 63x 기름 침지 렌즈로 전환하는 5 배 또는 10 배 렌즈를 사용합니다. 우리는 일반적으로 위상 대비 설정을 사용하지만, darkfield 광학은 잘 작동합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 가장 자주, 눈이 유전 화면의 일부로 또는 일반 눈 구조 또는 극성 중 하나에 영향을 미칠 것으로 알려진 유전자와 유전자 상호 작용을 테스트 과정에서 발견 외부 거친 아이 phenotypes에 대한 자세한 분석을 위해 플라스틱에 포함됩니다. 안과 섹션의 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. 야생 형 ommatidia (그림 3A)는 안료 세포의 격자에 둘러싸인 전체 photoreceptor의 보완을 보여줍니다. 반대로, 사시 (stbm, 일명 반 - 고흐 7) 돌연변이에 ommatidial 극성이 전체 photoreceptor의 보완이 존재하더라도, 분실 있으며, 회전과 chirality가 무작위 (그림 3B)입니다. 또한, sectioned stbm allele이 아에 이후 - 배경, 안료 과립은 그림 누락되었습니다. 3B. 그림 3C는 clonal 분석의 예제를 보여줍니다. Drosophila Rho 키나 아제 (drok)가 ommatidial 회전뿐만 아니라 눈 8 구조적 무결성을 위해 필요합니다. 야생에서 돌연변이 - Homozygous drok이 클론은 안료 세포와 rhabdomeres (일반적으로 안료의 부재에 의해 확인할 수 있습니다, 클론은 눈이없는 - FLP와 배경 w를 보완 강하게 표현 흰색 마커 유전자와 P - 요소를 사용 유도 아르 - 유형 및 heterozygous 조직). 그것은 안료 그들의 부족에 의해 돌연변이 영역을 식별할 수 있으므로이 가능합니다. R - CE의 착색의 휴대 자치으로 인해힘들 일찍, 개별 R - 세포의 genotypes합니다 (그림. 3C에서 화살촉 참조) 확인할 수 언급했다. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. Drosophila의 눈으로부터 생물학을위한 훌륭한 모델 시스템입니다, 야생 타입 눈 (A)의 매끄러운 표면에 대조적으로, 돌연변이 눈 표면은 외부 자주, (B) 거친 기본 안구 phenotypes을 나타내는 것입니다 . 모든 수치에서 앞의은 왼쪽이고 지느러미가있다. 박사 제니퍼 컬티스, NMSU, 라스 크루 시스, NM, 미국의 이미지 커터. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 설명한 방법을 사용 sectioned 단일 ommatidia의 빛 현미경 이미지. 맥도널드 R - 세포가 R8 위에 R7 자리잡고 있기 때문에, ommatidium마다 한 번에 볼 수 있습니다. (A는 A &#39;) (R7 수준에서 R7의 세포 시체는 R1 및 R6에 노란색 화살표) 사이의 감지. 반면, R8 수준 (B)에서, R8의 세포 시체는 R1 및 R2 (B에 노란색 화살표 &#39;) 사이에 감지됩니다. 블루 화살촉은 셀 자율 안료 마커로 사용할 수있는 안료 과립을 표시합니다. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 야생 - 타입 (A), stbm (B)와 drok (C) 돌연변이 성인 Drosophila의 눈을 통해 접선 섹션. 섹션 아래의 설계도는 ommatidia의 극성 (화살표위한 (A) 참조) 나타냅니다. 동그라미 photoreceptor의 보완에 결함이 ommatidia을 나타냅니다. 노란색 라인은 대칭의 지느러미 / 복부 라인 (적도)를 나타냅니다. (A) 야생 타입의 잘 지향 ommatidia 대조적으로, 평면 조직은 stbm 돌연변이 (B)에서 손실됩니다. 돌연변이 배경 - stbm 돌연변이의 섹션 표시 참고는 w에 의한 색소 부족합니다. drok의 변이가 있기 때문에 치명적인 (C), 그들은 클론으로 분석해야합니다. R - 세포 부족 색소 (오픈 파란색 화살촉)는 ​​homozygous 돌연변이있는 동안 따라서, 색소 세포는 (가득 푸른 화살촉) 야생 입력하거나 heterozygous 있습니다. 회전 결함 이외에 drok의 돌연변이도 R - 세포 없거나 초과 번호 포함 구조적 결함을 보여줍니다. clonal 분석, 섹션은 안료 과립을 왜곡하지 않도록 스테인드되지 않습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

모델 생물, 인간을 포함한 높은 eukaryotes에서 가장 높은 보존 신호 통로의 대부분에 필수적인 유전자 가족의 창립 멤버 많은 이들의 신분에 LED 유전자 화면으로 Drosophila을 사용합니다. , 실험실 조건 하에서 기능 눈이 생존을위한 소모품이기 때문에, 그 &#39;눈&#39;은 새로운 유전자 기능의 발견과 유전자 네트워크의 평가에 특히 적합 조직입니다. 설명한 방법을 사용하여 비행 아이의 Ultrastructural 분석함으로써 개발 및 질병에 해당하는 기본적인 발견되었다. 처음에는, 단일 세포 clonal 분석 알려져 밀접하게 연관된 세포 자치 열성 마커와 결합하여 X - 선 유도 클론을 사용하여 수행되었습니다. 최근 클론을 생성하는 FLP / FRT 시스템의 가용성이 크게 눈에 섹션 6,9에 치명적인 돌연변이의 phenotypic 분석을 촉진하고 있습니다. 안과 섹션의 분석은 여기에 설명된 접선 섹션에 국한되지 않습니다. 원하는 경우, 헤드는 금형의 모든 방향으로 정렬된 수 있으며, 가로 섹션은 얇은 판과 모수 같은 머리에 깊이 레이어를 연구받을 수 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 따라서 눈과 머리 구조 Drosophila 성인의 분석을위한 다양한 방법입니다.

일반 장비 : <ul><li> 일반 파리 축산위한 10를 참조 </li><li> 선호 손을의 그림자를 캐스팅 방지하기 위해 링 광원 표준 해부 현미경 (예 : 니콘 SMZ - 645 스테레오 줌 현미경). </li><li> 해부 동안 먼지에 대한 보호를 제공하기 위해 3MM 왓먼 종이로 덮여 CO 2 플라이 패드. </li><li> 젤라틴 코팅 슬라이드 : (물에 거의 가지고 약 2 시간 소요) 열판에 1L 물 10g 젤라틴과 1g CrKSO 4 X 12 H 2 O를 해산. 딥 (DH 2 O) 잘 씻어 (비누)와 씻어서 하룻밤 호일로 덮여 젤라틴 용액과 공기 건조에 소유자의 슬라이드. </li><li> 가열 오븐 (70 ° C, nitrocellulose 필터 건조에 사용된 오래된 진공 오븐 잘 이러한 목적으로 적합합니다.) </li><li> ultrathin sectioning의 (0.5-1 μm의 두께 부분) 가능 마이크로톰은 전자 현미경 시설 사용되는 예를 들어. 우리는 조직을 품질 다이아몬드 나이프로 Sorvall MT5000 Ultramicrotome을 사용합니다. 유리 칼도 작동합니다. </li></ul> 고정 솔루션 : <ul><li> 0.2 M의 인산 나트륨 버퍼, 산도 7.2의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> 0.1M의 인산 나트륨 버퍼, pH를 7.2 (4 ° C에 대한 사주에 저장할 수 있습니다)에서 2 % 글루 타 알데히드를 준비합니다. 당신이 포함하려는 유전자형 당 200μl를 적어도 충분합니다. 얼음 계속. </li><li> 오스뮴 솔루션 : 2% 0.1M의 인산 나트륨 버퍼, pH를 7.2로 오소 4. 솔루션 저장할 수 없기 때문에, 당신이 포함하려는 유전자형 당 200μl를에만 충분합니다. 얼음 계속. </li></ul> 글루 타 알데히드와 오소 4 매우 독성이 있으며 통풍이 잘되는 모자의 극단주의해서 다루어 져야합니다. 당신의 피펫의 blackening 방지하기 오소 4 다룰 때 필터 도움말을 사용하십시오. 탈수 : 30 %, 50 %, 70 %, (80 %), 90 %, 및 100 % 에탄올 솔루션을 확인하십시오. 가급적 30 % 쿨, 50 %, 사용하기 전에 얼음에 70 % 에탄올. 솔루션을 염색법 : 1 % 보락스에 Toluidine - 청색 1 %. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> 부드러운 </th><th> 하드 </th></tr><tr><td> 수지 </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> 경화제의 B </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> 가속기 C </td><td> 2.5G </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> 가소제 D </td><td> 10g </td><td> 0.75g </td></tr></tbody></table> 표 1. 수지 준비 신중하게, 수지를 준비하지만, 철저하게 대형 저어 바있는 자기 활동가를 사용하여 플라스틱 비이커에있는 모든 재료를 혼합한다. 거품을 피하십시오. -20 ° C.에서 표준 섬광 튜브 또는 이와 유사한 용기 동결에 혼합, 나누어지는 후 귀하의 EM 시설 더 어려워 수립을 요구하지 않는 모든 응용 프로그램에 대해 부드러운 수지를 사용하십시오. (그 unpolymerized 형태로 발암성) 수지를 처리​​하는 장갑을 사용하십시오. 70 ° C 야간에, 장비 및 폐기물에 굽기를 수지를 중합한다. 폐기물은 다음 안전하게 삭제 및 장비 세척 및 재사용 수 있습니다. 쏟았 unpolymerized 수지는 이소프로판올과 청소하실 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 공급 업체 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 패드 플라이 </td><td> 예 제네시 </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> 글루 타 알데히드 </td><td> 시그마 </td><td> G7526 - 10 X 10 ML </td></tr><tr><td> 오소 네 </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 0972A - 20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> 어부 </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> # 3 메스 핸들, </td><td> 어부 </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 # 11 </td><td> 어부 </td><td> 08-916 - 5B </td></tr><tr><td> 전송 pipettes </td><td> 어부 </td><td> 13-711 -은 7m </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM 수지 </td><td> 시그마 (Fluka) </td><td> 44610 - 1EA </td></tr><tr><td> 스틸 해부 바늘 </td><td> 어부 </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEM 평면 퍼가기 금형 </td><td> 전자 현미경 문화. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> 테플론 코팅 면도날 </td><td> 전자 현미경 문화. </td><td> 71,970 </td></tr><tr><td> Q - 팁 (멸균 면봉) </td><td> 어부 </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> 유리 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> 커버는 더 이상 1, 22X60 mm를 실수하면 안된다 </td><td> 어부 </td><td> 12 - 531K </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 어부 </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> CR (III) K 사 dodecahydrate SO </td><td> 시그마 </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> 6mm 다이아몬드 조직을 칼로, </td><td> Diatome 미국 </td><td> 60 그의 </td></tr><tr><td> Toluidine 블루 O </td><td> 어부 </td><td> BP107 - 10 </td></tr><tr><td> 보락스 (나 - 테트라 보 레이트) </td><td> 어부 </td><td> AC20629 - 1000 </td></tr><tr><td> DPX 장착 매체 </td><td> 시그마 </td><td> 44581 - 100ML </td></tr></tbody></table> 표 2. 자료

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

Drosophila는 오래 유전자 다루기 쉬운되는과 용이 주로 인해, 개발 연구를 모델 시스템으로 사용되고 있습니다. 수년에 걸쳐, 돌연변이 종자 및 기술 트릭의 과다는 복잡한 질문 및 시간의 합리적인 금액에 답변 수 있도록 개발되었습니다. 모든 알려진 주요 신호 경로의 구성 요소의 상호 작용에 근본적인 통찰력은 앞으로의 취득 및 유전자 Drosophila 연구를 반대하고 있습니다. 실험실 조건 하에서, 파리 기능성 눈없이 살아남을 수, 이후 플라이 눈, 유난히 잘 mutational 분석을 위해 적합한 것으로 입증되었습니다. 또한, 곤충 눈의 표면은 해부 현미경으로 바라 보았다 때 정기적으로 부드러운 표면을 형성 약 800 개별 단위 눈 (측면 또는 ommatidia)로 구성되어 있습니다. 각각 또는 전체 눈 크기 (에 따라 화면의 예를 보려면, 그러므로, 그것은 돌연변이가 외부에 매끄러운 표면의 손실 (그림 1. &#39;거친 눈&#39;표현형)을보고 안구 개발이나 성장에 영향을 미칠 수 있는지 쉽게 외부 눈 형태) 예 1을 참조하십시오. 눈 phenotypes 이후에 세부적인 분석은 고정, 플라스틱 퍼가기 성인 눈이 얇은 sectioning을 필요로합니다. Drosophila 아이는 소위 눈 imaginal 디스크 (검토 예 2 참조) 애벌레와 pupal 단계 동안 세포 분열 따위에 의해 번식하고 차별 상피 세포의 가방에서 개발하고 있습니다. 넷 렌즈 - secreting 콘 세포, 색소 세포 (R - 세포 클러스터 주변에 &#39;육각&#39;)와 브리슬, 각 ommatidium 여덟 photoreceptors (. 그림 2 PR 또는 R - 세포) 등 20 세포로 이루어져 있습니다. R8 [그림;, 가장 쉽게 가벼운 민감한 organelles, rhabdomeres, (R1 - 6) 6 &quot;객관적인&quot;두 &quot;주관적인&quot;photoreceptors (R7 / 8 이루어진 사다리꼴로 구성됩니다 각 ommatidium의 photoreceptors 확인 2.]) R7 아래이며 따라서에만 눈이 깊은 지역에서 섹션에 보았다. 각 패싯의 사다리꼴은 정확하게는 이웃과 눈 (그림 3A)의 전반적인 anteroposterior 및 dorsoventral 축의 기능과 정렬됩니다. 특히, 지느러미 및 복부 (각각 검은색과 빨간색 화살표)의 ommatidia은 눈의 반쪽은 서로의 미러 이미지이며 평면 세포 극성 신호 (검토 예 3 참조) 중 설립이 chiral 형식과 일치합니다. 세미 얇은 눈 섹션을 생성하는 방법 (예 : 그림 3.로 표시 것과)은 약간 원래 톰린슨 4 준비하여 설명하는 하나에서 수정됩니다 여기에 설명되어 있습니다. 그것은 투명한 원추 세포를 제외한 모든 세포의 형태학의 분석을 수 있습니다. 또한, R - 세포 (그림 파란색 화살촉. 2와 3)의 안료는 R - 세포의 유전자형에 대한 셀 - 자율 마커, R - 세포 수의 하위 집합에있는 유전자의 따라서 유전자 요건으로 사용할 수 있습니다 쉽게 5,6를 결정합니다.

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Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

어른을 준비하는 표준 방식<em&gt; Drosophila</em세미 - 얇고 sectioning 가벼운 현미경 분석을위한&gt; 눈이 여기서 제공됩니다. 프로토콜은 눈 결함의 총 형태학의 분석을 위해 사용할 수있는, 또는 지정된 조정은 안구의 특정 세포 유형 (photoreceptors의 예 clonal 분석)이나 전자 현미경 분석을위한 유전자의 유전 요구 사항을 결정하는 데 사용할 수와 함께.

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

preparation-adult-drosophila-eyes-for-thin-sectioning-microscopic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

16.1K 조회수.  Albert Einstein College of Medicine. 어른을 준비하는 표준 방식 Drosophila 눈이 여기서 제공됩니다. 프로토콜은 눈 결함의 총 형태학의 분석을 위해 사용할 수있는, 또는 지정된 조정은 안구의 특정 세포 유형 (photoreceptors의 예 clonal 분석)이나 전자 현미경 분석을위한 유전자의 유전 요구 사항을 결정하는 데 사용할 수와 함께.

비디오: Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Immunohistochemistry에 대한 슬라이스 준비 씬 Sectioning

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

성인 Drosophila의 머리에서 전체 셀 레코딩

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

성인 마우스 Hippocampal 이가있는 이랑의 해부

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

항체 라벨링에 대한 Drosophila Polytene의 염색체 Squashes의 준비

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

의 준비 Drosophila</em라이트 현미경을 위해> S2 세포

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

성인의 준비 Drosophila 눈

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