Perls/DAB 염색에 의한 5xFAD 마우스의 뇌 내 철 침착 평가

이 프로토콜의 목표는 AD 마우스 모델의 뇌에서 철 침착의 양과 분포를 평가하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 8개월 된 5xFAD 형질전환 마우스를 AD 마우스 모델로 사용하고 동일한 나이의 야생형 마우스와 비교했습니다. 화학 시약 준비, 뇌 절편, Perls/DAB 염색 수행 및 결과 이미지 분석 절차에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

마우스를 적절하게 마취하고 마취 및 진통제의 깊이를 확인하십시오. 심장을 드러낸 다음 오른쪽 심방을 잘라냅니다. 좌심실에서 20ml PBS와 4%PFA를 순차적으로 주입합니다.

고정 떨림을 관찰해야 합니다. 쥐의 목을 베고 뇌를 추출합니다. 그런 다음 12-24시간 동안 4% PFA로 뇌를 고정합니다.

12-24시간 동안 뇌를 15%와 30%의 자당에 담그십시오. 뇌를 중간부터 궁수적으로 잘라내고 양쪽 절반을 절편으로 사용합니다. 손잡이에 뇌를 장착하고 뇌 주위에 은박지 고리를 끼우고 OCT를 추가하여 뇌를 내장합니다.

절편의 두께와 저온 유지 장치의 온도를 설정합니다. 그런 다음 뇌를 자릅니다. 섹션이 접히면 부드러운 브러시를 사용하여 섹션을 펼칩니다.

PBS를 사용하여 슬라이드의 각 섹션을 수집한 다음 섹션의 기포를 제거합니다. 뇌 조직이 손상되지 않은 슬라이드를 선택하여 PBS로 채워진 플라스틱 염색 상자에 넣습니다. 상자를 회전식 셰이커에 놓고 5분 동안 저속으로 설정하여 잔류 OCT 화합물을 완전히 헹굽니다.

20ml의 2% 페로시안화칼륨과 같은 부피의 2%염산을 준비합니다. 그런 다음 50ml 원심분리기 튜브에 섞습니다. 집게를 사용하여 슬라이드를 튜브에 고정하고 혼합물을 섭씨 60도로 예열된 수조에서 30분 동안 배양했습니다.

PBS로 슬라이드를 씻고 티슈 페이퍼를 사용하여 여분의 액체를 닦아냅니다. 슬라이드를 실험실 벤치에 평평하게 놓고 피펫을 사용하여 조직 위에 DAB 용액을 바르기도 합니다. Perls 염색을 향상시키기 위해 10분 동안 배양합니다.

과도한 DAB 용액을 제거하고 PBS로 세 번 씻어 티슈를 헹굽니다. 등급이 매겨진 알코올 용액과 자일렌으로 섹션을 각각 3분씩 순차적으로 탈수합니다. 중성 껌과 커버 슬립으로 섹션을 덮으십시오.

그런 다음 흄 후드에서 말리십시오. 현미경을 켭니다. 광원의 밝기를 조정합니다.

4X 배율 대물렌즈에서 뇌 부분에 초점을 맞춥니다. 현미경 스테이지를 이동하여 Perls/DAB 염색 신호가 높은 영역, 특히 해마와 대뇌 피질에 초점을 맞춥니다. 그리고 이미지를 캡처합니다.

대물렌즈 이미지를 10배율로 연 다음 이미지 형식을 8비트 회색조로 변환합니다. 이미지의 회색 값을 OD 값으로 변환한 다음 threshold 함수를 사용하여 Perls/DAB 염색 양성 영역을 커버했습니다. 다음 설정 옵션을 선택하고 가장 중요한 것은 한계치 한계를 선택하여 배경 소음을 제외하는 것입니다.

마지막으로, 통계 분석을 위한 결과를 얻기 위한 측정값을 선택합니다. AD 마우스 모델에서 철의 분포 및 축적을 조사하기 위해 시상 뇌 절편에 대한 Perls/DAB 염색을 수행했습니다. 높은 Perls/DAB 신호는 해마와 피질, 특히 5xFAD 마우스의 해마 하부에서 관찰된 반면, 2개월과 8개월 야생형 마우스의 뇌는 더 약한 신호를 보였습니다.

40 이상의 배율에서 5xFAD 마우스의 신호는 이전 연구와 일치하는 A-베타 플라크와 같은 구조로 나타납니다. 이러한 결과는 철 검출을 위한 조직화학적 기법으로 자리 잡은 Perls/DAB의 효과를 보여줍니다. 또한 염색에 실패한 두 가지 사례도 보여줍니다.

과도한 덮개 또는 부적절한 탈수로 인해 이러한 경우가 발생할 수 있습니다. Perls/DAB 염색은 기존 Perls 염색보다 더 강한 신호와 더 나은 배경 대비를 제공하여 철 검출을 더 민감하고 정확하게 만듭니다. 또한 느슨하게 결합된 단백질 복합체에서 철을 검출합니다.

헤모글로빈과 같이 강하게 결합된 철은 반응하지 않습니다. 이것은 적혈구와 헤모글로빈의 철분으로 인한 원치 않는 신호를 크게 줄입니다. 전반적으로 Perls/DAB 염색은 내측 특이성과 민감성이 필요한 동물 실험 및 병리학적 조사에 적합합니다.

이는 연구자들에게 더 적은 시간과 비용을 희생하면서 철 축적을 시각화하고 정량화할 수 있는 방법을 제공합니다.