우리는 프로젝트에 자신의 엄청난 지원 씨 ENES 메 흐멧, 미스 키아라 엔드 레데, 미스 필로드 리 게스, 크리스 곽, 그리고 양 다나 Ghafir을 인정합니다.

뇌 해부 및 면역 형광 염색에 사용 1. 솔루션 <ol><li> 성인 인공 뇌척수액에서 머리를 비행 해부 (ACSF) : 119 mM의 NaCl을, 26.2 밀리미터의 NaHCO3, 2.5 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 NaH 2 PO 4, 1.3 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 포도당. 사용하기 전에, 가스 5 % CO 구십오분의이 10 %의 O 2와 ACSF - 2.5 mM의 CaCl2를 15 분, 스파이크. 0.22 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 용액 ACSF 멸균. 참고 : 저장 ACSF를 4 ° C에서 세균 오염을 방지 할 수 있습니다. 해부 뇌의 최종 이미지 품질에 두 박리 용액의 효과의 상세한 비교가 수행되지 않은 비록 플라이 뇌 또한, 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액에 절개 될 수있다. </li><li> 일반적으로 분주 및 -20 ° C에 저장되어있는 정착액 솔루션으로 1X PBS에서 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용합니다. CautioN : PFA는 독성과 부식성 및 취급시주의해야한다. </li><li> 해부 뇌의 면역 염색하는 동안 뇌에서 마지막 세척 단계 후 PFA를 씻어 1X PBS를 사용합니다. 10 배 PBS 원액에서 1X PBS를 준비 (1.37 M의 NaCl, 27 mM의 KCl을, 100 밀리미터 나 2 HPO 4, 18 mM의 KH 2 PO 4). </li><li> 해부 뇌의 면역 염색 동안 모든 후속 세척 단계 1X PBS (1X PBT)에서 0.3 % 트윈 20을 사용합니다. </li></ol> 성인 플라이 헤드 2. 미세 수술 해부 주 : 박리 과정이도 1에 도시되어있다. <ol><li> CO 2와 함께 성인 파리를 마취. 5 초 - 집게를 사용하여 비행을 선택하고 짧게하면 3 70 % 에탄올에 침지하여 표피를 왁스 제거. 이 ACSF 또는 1X PBS의 해부 용액에 침지 할 때 기포가 비행 표피에 부착 없음을 보장합니다. </li><li> 아래손에 의해 차단되지 않습니다 각도에서 광원 현미경을 해부, 파리 (1.2X 배율)의 명확한 뷰를 달성하기 위해 대물 렌즈를 설정합니다. 동물을 고정하고도 1a에 도시 된 바와 같이, 그것의 복부가 위쪽으로 향하도록 추위 해부 솔루션으로 파리를 체험하기 위해 쓰지 않는 손으로 집게를 사용합니다. </li><li> 160에서 집게를 유지 - 파리의 복부에 작은 힘을 발휘하면서, 해부 접시에 대해 170 ° 각도 (그림 1A에서 화살표로 도시). 이 단계는 플라이 및 고정 (15)에 의해 후방으로 헤드를 이동하도록 강제 - 25 ° 위쪽 코를 확장하는 동안. 이 과정에서, 표피의 소프트 및 반투명 영역은 코 아래에 명백해질 것이다. 배율을 증가시키고이 지역에 초점면을 조정합니다. 참고 : 너무 단단히 집게를 잡지 마십시오,하지만 충분히 아니라 그냥 회사 안정비행. 너무 많은 힘은 내부 장기 용액에 파열의 원인이됩니다. </li><li> 유지 손에서 압력이 해제 될 때 집게가 열려 봄 않도록, 포셉의 조언에 가벼운 저항하는 힘을 생성합니다 그것의 끝이 폐쇄되도록 해부 집게를 눌러 지배적 인 손을 사용합니다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 비행을 들고 집게에 수직으로 집게를 놓습니다. <ol><li> 피어스 그림 1B에서 빨간색 화살표로 도시 된 바와 같이 코 아래에있는 표피의 부드럽고 반투명 영역을 통해 해부 포셉의 폐쇄 팁. 너무 깊이는 뇌에 접촉하는 집게를 관통하지 않는 것이 중요합니다. 적절한 뇌는 볼 수있게한다. 비 우세 손으로 파리의 안정적인 권력을 유지한다. </li></ol></li><li> 신속하지만 꾸준히, t 자신의 힘에 의해 해부 포셉의 팁을 해제하고 멀리 눈물이 릴리스에서 모멘텀에 의존그는 외골격 플라이 머리 주변. 볼이되어야 적절한 손상되지 않은 뇌 (즉시 그림 1C에서 바닥 forcep의 끝 위의 흰색 조직) (그림 1C에 도시 바깥쪽으로 빨간색 화살표로 도시)를 출시 forcep 팁의 모멘텀을 안내하는 가상 선을 따르십시오. 이 부드럽게 외골격을 제거하고 뇌에서 뇌 관련 눈과 기관의 가장 것입니다. 적절한 타이밍과 힘은 외골격은 연구자의 경험에 의존 할 것이다 열 적용했다. 참고 :이 해부하는 동안 가장 중요한 단계입니다. 이는 노출 된 뇌 떠나는 것은 신체의 나머지에 부착 된 상태로 남아 외골격을 제거 개구 포셉 운동량으로부터 발생하는 자연의 힘에 의존하는 것이 중요하다. </li><li> 조심스럽게 백색 섬유 구조로 표시되는 기관으로 남은 액세서리 조직을 제거하는 지배적 인 손에 집게를 사용 remainiNG는 뇌에 연결합니다. 당기거나 적절한 뇌 손상되지 않도록주의하십시오. </li></ol> 뇌의 3 면역 형광 염색법 <ol><li> 60 분 - 40 4 % PFA의 약 1 mL에 관련 흉상과 함께 해부 뇌 샘플을 수정합니다. 참고 :이 이후의 단계는 제대로 용액에 시료를 혼합하는 nutator에 샘플 튜브 또는 플레이트를 유지합니다. </li><li> 아래로 3 번 용액을 위로 피펫 팅에 의해 1X PBS 1 mL로 씻어. 떨어져 머리를 대기음하지 않도록주의하십시오. </li><li> 5 분마다 1 배 PBT와 5 회 반복한다. 배양하는 동안 nutator에 샘플을 보관하십시오. </li><li> 4 ° C에서 / 적절한 희석 O에서 일차 항체와 N을 품어. </li><li> 다음 날, 차 항체를 제거하고 1X PBT와 샘플을 5 회 반복한다. 각 세척 사이에 1 배 PBT 용액에 10 분 - 5 샘플을 남겨주세요. 배양하는 동안 nutator에 샘플을 보관하십시오. </li><li> 세척을 품어제안 된 희석 및 배양 시간에 적절한 보조 항체의 샘플. </li><li> 각 세척 사이에 10 분 배양과 1X PBT와 샘플을 여섯 번 씻으십시오. 이 단계는 샘플에서 비특이적 결합 이차 항체의 제거를 위해 중요하다. </li><li> 30 분 동안 1X PBT 용액 1 ㎎ / ㎖ 4 &#39;, 6&#39;- diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 10,000 희석 1 부화. DAPI는 DNA의 AT 영역에 결합하고, 뇌의 전반적인 형태를 나타 내기 위해 사용될 수있는 DNA 염료이다. </li><li> 1X PBS로 3 회 씻어. </li><li> 전송 해부 접시에 샘플, 그리고 집게를 사용하여 절개 접시에 시체에서 머리를 분리합니다. </li><li> 염색 및 세척 단계 후, 둘 사이의 커버 슬립의 두뇌를 탑재하고 장착 슬라이드의 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 뇌의 양쪽이 동일한 신호 강도로 이미징 될 수 있도록 이러한 방법으로, 뇌 샘플 용이 대칭 될 수있다. <strong&gt; 참고 : 대신 직접 장착 슬라이드의 커버 슬립의 뇌를 장착하여 자유롭게 샘플의 방향의 반전을 할 수 있습니다. 실장 공정은 아래에서 더 상세히 설명한다. <ol><li> 장착 슬라이드의 상단에 18 X 18mm의 coverslip에 배치합니다. 블레이드와 피펫 팁의 개구를 넓히고 18 X 18mm의 커버 슬립 상 1X PBS 용액에 뇌를 전송하도록 사용. </li><li> 안티 - 페이드 장착 매체의 40 μL (0.2 % (99.5에서 w / v)의 n- 프로필 갈 레이트 - 다른 (20), 커버 슬립의 중간에 두뇌를 놓습니다 미세 피펫 팁과 뇌 주변의 액체를 제거하고 추가 뇌 % 이상 ACS 등급 글리세롤). 주 : 배지 첨가 실장 양 검사 뇌의 수에 의존한다. </li><li> 바깥쪽으로 점성 장착 매체 변위 동안 부드럽게 머리를 확산. 그것은에 닿을 때까지 제 일측에서 상기 슬라이드를 하강시킴으로써 뇌의 상단에 제 18 X 18mm의 커버 슬립을 배치장착 미끄러짐 표면은 천천히 기포와 뇌의 접촉을 최소화하기 위해 다른 쪽을 낮추는. 주 : 장착 매체의 볼륨으로 두 커버 슬립 사이에 스페이서를 사용하고 뇌 두 커버 슬립을 분리하기에 충분한 공간을 제공해야 할 필요가 없다. </li><li> 슬라이드가 정착하도록 허용합니다. 실험실 조직과 슬립의 측면에서 나오는 과도한 액체를 제거합니다. </li><li> 운송시 장착 슬라이드를 탈락 탑재 된 두뇌와 커버 슬립을 방지하기 위해 장착 슬라이드로 된 커버를 부착하는 테이프의 작은 조각을 사용합니다. 주 : 뇌에 장착 된 슬라이드를 즉시 묘화 또는 슬라이드를 밀봉하는 밀봉 제를 사용할 필요없이, 형광 신호의 현저한 손실없이 1 주 4 ℃에서 보존 될 수 사이. 스테인드 뇌 장기 보존 두 슬립의 측 w를 밀봉 할 수있다i 번째 네일 폴란드어 및 저장 -20 ° C의 냉동고, 스테인드 뇌가 시간이 지남에 따라 자신의 신호를 잃을 수도 있지만. 이 권장되지 않습니다. </li></ol></li><li> 이미지에 머리를 적절한 화합물 형광 현미경 공 초점 현미경을 사용합니다. <ol><li> 우선, 목적에 가까운 뇌 측으로부터 화상을 취득하고 신중 중간에 끼워진 샘플을 갖도록 플립 커버 슬립. 이 단계는 같은 뇌의 다른 쪽의 화상을 취득 용이하게한다. </li><li> (예를 똑바로 화합물 형광 현미경 및 이미지에 20 배 대물 렌즈 전체 뇌 (그림 2의 예) 및 한 쌍의 전방 내측 (PAM) 클러스터 지역에서 DA 뉴런과 뇌의 이미지 작은 지역에 40X 목표를 사용하여 그림 3). </li></ol></li></ol>

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H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+s-transferase+omega+1+activity+is+sufficient+to+suppress+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease.">Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

인간의 뇌 질환, 신경 회로, 및 높은 뇌 기능을 연구하기 위해 성인 초파리 뇌 사용에 대한 관심이 증가, 대형 - 특히 중요 전체 마운트 분석을위한 완전한 비행 뇌를 얻었다 간단하고 빠른 방법을 개발하는 것이 필요하다 뇌 기반의 화면을 확장 할 수 있습니다. 우리의 방법은 간단하고 배우기 쉬운 플라이 머리를 해부하는 방법을 (자주 경험 미만 10 초에) 잘 보존 된 형태와 크게 관련 조직?...

일반적으로 과일 파리로 알려진 모델 생물 초파리는 긴 우아한 유전 도구, 짧은 생식 번 평가하고, 높은 분자 및 세포 경로를 보존하고있다. 초파리 성공적 기본 신호 경로 다세포 유기체의 패터닝 메커니즘뿐만 아니라, 신경 발달 기능의 기초가되는 메커니즘 질병 1,2- 해부하는데 이용되어왔다. 셀 라벨 및 이미징 기술의 최근 발전과 함께, 초파리의 뇌는 신경 회로의 미세 매핑 및 학습과 기억, 그리고 활동 일주기 1,3와 같은 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초를 해부 특히 강력한되고있다 4,5,6,7,8. 초파리 시스템의 하나의 특별한 장점은 일정한 화합물 또는 공 초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 전체 뇌 실장 준비 및 시험 수는 상대적으로 작은 크기이다. 티S 기능 따라서 전체 내에서 연구 된 환자의 전체적인 관점 그 정확한 형상을 모두 제공하는 전체 뇌 조직의 맥락에서, 세포 및 세포 내 수준의 신경 회로의 상세한 해부학 및 기능 분석 또는 단일 뉴런을 활성화 뇌. 그러나, 뇌의 미니어처 크기보다는 주어진 또한 효율적 성인 플라이에 보호 외골격 헤드 케이스로부터 온전한 ​​뇌 조직 해부의 기술적 과제를 제시한다. 다양한 효과적이고 상대적으로 단순한 박리 방법은 일반적주의 포함하고 단계적 헤드 케이스를 제거하고 눈을 포함한 관련 조직, 기관, 지방을 9,10. 이러한 미세 수술 절개 방법 적절한 뇌로부터의 상세히 설명되었지만 자주 쉽게 손상 될 수있는 미세 잘 정렬 된 팁 집게에 의존 해부 포셉의 품질에 다소 엄격한 요구를 배치합니다. 또한, 같은 해부 뇌는 종종 해부하다신체의 나머지 에드 뇌 쉽게 그들의 작은 크기 및 프로세싱 버퍼 투명성의 연속 염색 및 세척 과정 중에 손실 될 수있다. 여기, 우리는 몸통에 부착 된 해부 두뇌를 유지 성인의 뇌에 대한 비교적 간단하고 배우기 쉬운 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다. 해부 과정은 종종 쉽게 눈과기도로 뇌 관련 조직의 대부분을 멀리 지우고 좋은 품질의 해부 포셉에 대한 수요를 감소시킨다. 형광 화합물 현미경 또는 공 초점 현미경으로 뇌를 영상화 할 때 또한, 멀리 형광 광원으로부터 뇌의 측면은 종종 인해 전체 마운트 뇌의 두께로 약한 신호와 적은 선명한 이미지를 생성합니다. 여기서는 유사한 신호 intensi와 뇌의 양측의 편리한 촬상있게 뇌 샘플 쉽게 반전을 허용하는 간단한 장착 방법을 서술타이 및 품질. 개념 증명 성인의 뇌를 연구하는이 방법의 응용 프로그램에 대한, 우리는 또한 1118 파리 w의 뇌에서 DA 뉴런의 존재를 조사; 종종 유전자 파리 많은 초파리 연구 야생형 제어를 생성하기위한 부모 선으로 사용되는 유전자형.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1320">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:573px;">w*;&#160;park&#916;21/TM3,&#160;P{GAL4-Kr.C}DC2,&#160;P{UAS-GFP.S65T}DC10,&#160;Sb1</td>
			<td style="width:311px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:151px;">51652</td>
			<td style="width:287px;">Balancer was switched to TM6B</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">PBac{WH}parkf01950</td>
			<td>Exelixis at Harvard Medical School</td>
			<td>f01950</td>
			<td>Balancer was switched to TM6C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">NaCl</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S640-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:573px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">02-003-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:573px;">Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td>Replaces glucose</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:573px;">Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMD Millipore&#160;Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22&#181; Pore Size</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>GVWP14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Formalin Solution, 10% (Histological)</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Tween 20</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-055</td>
			<td>Protocol does not require very fine points.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">P40101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav</td>
			<td>The Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>Clone 7E8A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td style="width:311px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:311px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">A-11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:311px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propyl gallate powder</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3130-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Glycerol ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss Axioimager Z1</td>
			<td style="width:311px;">Zeiss</td>
			<td style="width:151px;">Quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Zeiss Apotome.2</td>
			<td style="width:311px;">Zeiss</td>
			<td style="width:151px;">Quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:573px;">Zen lite software</td>
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:151px;">Quote</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult drosophila brains

인간의 뇌 퇴행성 질환 모델 성인 뇌에서 신경 회로들을 매핑하고, 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초 공부 초파리 사용에 관심이 증대되고있다. 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 전체 마운트 준비는 전체 뇌 기반 연구를위한 중요하지만, 기술적으로 어렵고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이후의 처리 단계를 용이하게하기 위해 본체의 나머지에 부착 된 그대로의 뇌를 유지하면서,이 프로토콜은, 이하 10 초에서 성인 플라이 머리 쉬운-내용 원스텝 절개 방법을 설명한다. 이 절차는 일반적으로 나중에 묘화 공정을 방해 할 수있는 뇌와 관련된 눈 기관 조직의 대부분을 제거하는 것을 돕고, 또한 해부 포셉의 품질에 덜 요구 놓는다. 또한, 우리는 (B)의 양쪽을 이미징 중요 커버 슬립에 장착 뇌 샘플의 편리 반전을 가능하게하는 간단한 방법을 설명비슷한 신호 강도 및 품질 비. 프로토콜의 예로서, 우리는 WT 성인 뇌에서 도파민 (DA) 신경 세포의 분석을 제시한다 (1,118와트) 날아간다. 절개 방법의 높은 효능은 초파리에서 대규모 성인 뇌 기반 연구에 특히 유용합니다.

상술 한 바와 같이 그림 1, 성인 뇌 해부를위한 주요 절차를 보여 2 및도 3은 3 일짜리 WT의 대표 이미지입니다. (유전자형가 : 1,118 원) 성인 티로신 하이드 록에 대한 항체와 costained 된 머리를 비행 (TH를 그림 2에서 빨간색으로 색깔과 그림 3) 흰색, 마커는 일반적으로 모든 분화 된 신경 세포의 모...

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A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

a-simple-one-step-dissection-protocol-for-whole-mount-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

27.0K 조회수.  The University of Texas Health Science Center at Houston.  성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다. 

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

연구

신경과학

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

성인 전체 마운트 준비 Drosophila</em장 섬유 염료 주입을위한> 복부 신경 코드

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

전신 탈염 신경 근육 정션 분석을위한 트랜스 대 복부 근육의 해부

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...