이 시간 절약 방법은 해부학과 국소 단백질 및 조직의 시각화를 최적화하기 위해 신경 과학 연구에서 면역 조직 화학 적 절차의 라운드 사이의 가변성을 감소시킵니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 뇌를 하나의 냉동 블록으로 결합하여 저온 절에 걸리는 시간을 줄이고 뇌 조직을 탑재한다는 것입니다. 이 기술은 설치류 두뇌의 관상 동맥 단면도에 최적화되어 있는 동안, 그것은 좌활또는 횡방향 단면도 또는 근육 또는 간과 같은 조직의 다른 모형에 적응할 수 있습니다.
성공적인 환갑 관류에 따라 PBS에서 25 밀리리터 바이알에서 동물의 뇌를 24 시간 동안 수정하십시오. 그 후, 무딘 기울어진 집게를 사용하여 파라포름알데히드에서 뇌를 제거하십시오. TBS에서 약 20 밀리리터30%의 자당 용액으로 뇌를 유리병으로 옮는다.
그들은 유리병의 바닥에 가라 앉을 때까지 뇌와 해결책을 유지합니다. 다음으로, 얼음 양동이에 드라이 아이스 침대에 500 밀리리터 유리 비커를 놓습니다. 그런 다음 300~400밀리리터의 이스펜타네를 비커에 붓습니다.
음수 45도에서 음수 50°C 사이의 isopentane을 유지합니다. 벤치 탑에, 최적의 절삭 온도 또는 OCT 화합물로 전체 약 절반 으로 전체 일회용 포함 금형을 채웁니다. 바늘을 사용하여 금형에서 기포를 제거하십시오.
무딘 기울어진 집게를 사용하여 자당 용액에서 첫 번째 뇌를 제거하십시오. 그런 다음 반구를 분리하기 전에 새 면도날을 사용하여 소뇌 및 후각 전구를 제거합니다. 다음으로, 뇌에게 숫자 명명 시스템을 제공합니다.
무딘 집게를 사용하여, 위치 2에 배치 할 뇌를 데리러, 먼저 위쪽으로 향하고 절단 할 측면과 방향을 지정합니다. 10 월에 뇌를 낮추고 독립적으로 서 때까지 위치를 조정 하는 핀셋을 사용 하 여. 이 기술의 주요 수정은 위치 1의 빈 공간입니다.
이 공간은 메가 브레인 방향을 쉽게 식별할 수 있도록 지정되어 각 뇌와 관련된 동물을 식별합니다. 모든 뇌가 금형에 배치 된 후, 뇌의 상단을 커버하기에 충분한 OCT를 추가 한 다음 바늘을 사용하여 기포를 제거하십시오. 포셉이 10월에 부분적으로 침수되지 않도록 포셉으로 금형 의 모서리를 잡으십시오.
그런 다음 금형의 하단 3분의 1이 침수되도록 금형을 isopentane으로 낮춥시다. 30초 후에 전체 금형을 isopentane으로 낮추고 집게에서 놓습니다. 3분 후, 집게를 사용하여 이스펜타네에서 금형을 제거합니다.
즉시 금형과 그 내용물들을 알루미늄 호일로 감싸서 적절하게 라벨을 붙입니다. 메가브레인을 최소 24시간 동안 음수 섭씨 20도의 냉동고로 옮춥니까. 첫째, 저온 캐비닛의 온도를 섭씨 19도로 설정합니다.
냉동고에서 메가 브레인을 제거하고 냉동고에 놓습니다. 그런 다음 척과 얇은 기울어진 페인트 브러시 두 개를 저온스트에 놓습니다. 그 후 슬라이드에 메가브레인 식별 번호와 슬라이드 번호로 레이블을 지정하고 슬라이드 워머에 슬라이드를 배치합니다.
다음으로, 거대 두뇌를 풀고 면도날을 사용하여 금형의 모서리를 잘라냅니다. 10월의 얇은 층을 척에 분배합니다. 그런 다음 빠르게 척에 메가 브레인을 배치합니다.
OCT가 완전히 동결 된 후, 메가 브레인의 측면에 10 월의 2 밀리미터 층을 적용하고 척에 측면을 실행 할 수 있습니다. 면도날을 사용하여 척의 측면과 바닥에서 초과 10월을 제거합니다. 첫째, 척이 크머리헤드에 메가브레인장착을 장착한 척을 저온스트의 척 머리에 놓습니다.
그런 다음 냉동고스트를 원하는 두께로 설정합니다. 조직 수집을 위해 원하는 뇌 영역에 도달하기 위해 필요에 따라 OCT 및 조직을 다듬습니다. 그런 다음 무대에 놓을 때까지 롤 방지 판을 낮추고 극저온 핸들을 돌려 단일 섹션을 수행합니다.
티슈 섹션이 닿지 않도록 주의하면서 롤 방지 판을 천천히 들어 올립니다. 페인트 브러시를 부드럽게 사용하여 평평하게 놓일 때까지 티슈 섹션을 풀수 있습니다. 필요한 경우 페인트 브러시를 사용하여 OCT 플랫을 유지하여 롤링을 방지합니다.
그런 다음 슬라이드 워머에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드 레이블 측면을 메가브레인 섹션 위로 마우스를 가져가서 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 신속하게 조직 섹션에 PBS의 한 방울을 적용합니다. PBS에 담근 미세한 팁 페인트 브러시를 사용하여 조직 섹션의 거품을 털어 내고 조직을 펼치므로 슬라이드에 평평하게 놓여 있습니다.
마지막으로 슬라이드 워머에 슬라이드를 45분 동안 건조시키고 슬라이드를 섭씨 80도에 저장합니다. 이 프로토콜에서, 9개의 동물에게서 두뇌 조직은 동시에 준비되고 저온분해되었습니다. 냉동 절제 후, H&E 염색은 극저온 보호 품질을 평가하기 위해 수행 될 수있다.
이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1개 또는 마이크로글리아의 이바1 염색의 대표적인 결과는 단일 메가브레인에 대한 각 연구 뇌 간의 일관된 염색을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 균열 또는 해동을 방지하고 비정상적인 조직 무결성으로 이어지는 조직의 동결을 방지하기 위해 메가 브레인을 동결하면서 지속적으로 온도를 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 염색 하는 동안 그룹 간의 차이를 만들 수 있습니다 및 이미징 및 분석 하는 동안 편견과 주관성을 줄일 수 있기 때문에 별도 메가 브레인에서 다른 치료 그룹을 분리 하는 것이 좋습니다.
paraformaldehyde와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 PBE착용 및 후드 작업과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.
