폐섬유증의 쥐 모델에서 Bleomycin의 구인두 투여

우리의 연구는 폐섬유증의 발병기전의 기저에 있는 면역 메커니즘을 이해하고자 합니다. 이 분야의 가장 큰 과제 중 하나는 체외 및 생체 내 모델을 인간 폐 섬유증으로 변환하는 것입니다. 폐 섬유증을 연구하기 위한 많은 동물 모델이 존재합니다.

우리는 가장 일반적으로 사용되는 모델 중 하나인 블레오마이신 쥐 모델을 표준화하여 다른 실험실에서 쉽게 사용할 수 있도록 하려고 합니다. 우리는 폐 섬유증의 쥐 모델에서 블레오마이신을 투여하는 최소 침습적이고 재현성이 높으며 안전한 방법을 제시합니다. 이 동물 모델은 인간 연구의 시험관 내 연구를 보완합니다.

여기에는 발병에 중요한 세포 유형을 실행하고 부상 중에 발생하는 환기, 관류 및 가스 교환의 변화를 생리학적으로 복제하는 것이 포함됩니다. 우리는 in vivo에서 조직병리학적 중증도를 심각하게 감소시키는 중재가 더 나은 임상 결과를 나타낼 수 있다고 예측합니다. 적절한 화학 요법 예방 조치를 따르는 동안 화학 물질 후드에서 블레오마이신 용액을 준비하십시오.

먼저 블레오마이신 분말을 멸균 PBS에 용해시켜 밀리리터당 10단위의 스톡 농도를 준비합니다. 사용된 특정 블레오마이신과 실험 목적에 따라 체중에 따라 필요한 용량에 따라 최종 작업 농도를 준비합니다. 최종 투여량을 조정하려면 블레오마이신을 밀리리터당 0.375 단위로 희석하여 25g 마우스의 총 부피가 50 밀리리터가 되도록 합니다.

적절하게 마취된 마우스를 앞니에 매달아 60-80도 각도로 시술 플랫폼에 매달아 구인두를 효과적으로 엽니다. 구인두를 통해 호흡을 유도하기 위해 부드러운 미세혈관 클램프를 사용하여 비강을 막습니다. 집게를 사용하여 구인두에서 혀를 빼냅니다.

스터브 루어 스터브 팁이 있는 스테퍼 피펫을 사용하여 원하는 양의 블레오마이신 또는 식염수 조절제를 구인두 뒤쪽에 부드럽게 놓습니다. 눈에 보이는 액체 거품이 완전히 눈에 띄는지 확인하십시오. 마우스가 용액을 흡인할 때까지 혀를 제자리에 계속 유지하면 용액이 눈에 띄고 종종 청각적으로 분명해집니다.

흡인이 확인되면 코 클립을 조심스럽게 제거합니다. 쥐를 케이지로 되돌리기 전에 블레오마이신 용액이 역류하지 않는지 확인하기 위해 15초 동안 매달린 위치에서 마우스를 관찰합니다. 그런 다음 열 중성을 유지하기 위해 아래에 가열 패드가 있는 케이지에 동물을 옆으로 눕힙니다.

발가락을 부드럽게 꼬집고 동물이 더 쉽게 깨어날 수 있도록 진온선 상태를 유지하도록 합니다. 생쥐가 완전한 의식을 회복할 때까지 모니터링하며, 케타민 복용량과 동물 크기 및 신진대사에 따라 일반적으로 1-2시간이 걸립니다. 체중, 그루밍, 활동 수준 및 호흡기 상태의 변화에 대해 매일 마우스를 임상적으로 모니터링합니다.

모델의 효과에 대한 핵심 마커로 무게를 추적합니다. 적절한 시기에 적절하게 안락사된 쥐의 폐를 적출합니다. 조직학을 위해 블록의 폐를 절개하고 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정합니다.

헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 또는 Masson's trichrome을 사용하여 파라핀 포매, 절편 및 염색을 진행합니다. 수용성 콜라겐 측정을 위해 오른쪽 폐를 균질화합니다. 유세포 분석의 경우, 조직 해리기와 효소 용액을 사용하여 오른쪽 폐를 분해하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

표준 프로토콜에 따라 유세포 분석 염색 및 분석을 수행합니다. PBS 대조군과 비교하여, 폐포 중격과 작은 염증성 또는 섬유성 부위의 섬유성 변화가 블레오마이신으로 처리된 폐 샘플에서 7일째까지 관찰되었습니다. 14일째가 되자, 더 크고 더 밀집된 섬유화 부위가 정상 폐포 구조에 상당한 파괴와 함께 나타났다.

21일째까지 섬유성 변화는 더 이상 큰 증가 없이 지속되었습니다. 수정된 Ashcroft 채점 시스템은 14일과 21일 사이에 섬유증 수치가 비슷하다는 것을 확인했습니다. 14일째에 수행된 하이드록시프롤린 분석은 대조군에 비해 블레오마이신 처리된 폐의 총 수용성 콜라겐 함량이 증가한 것으로 나타났습니다.

정량적 중합효소 연쇄 반응 분석은 블레오마이신에 대한 반응으로 profibrotic 유전자 Col1A1 및 TGFB의 상향 조절을 보여주었습니다. 유세포 분석 결과, 폐에 간질성 대식세포(interstitial macrophage), 단핵구(monocyte-derived alveolar) 대식세포, 호중구(houtrophil)를 포함한 골수성 세포의 강력한 침투가 밝혀졌습니다.