저자 Demêmes 다니엘과 더글러스 Cotanche 감사의 마음을 우리에게 Corti의 기관의 격리를 위해 방법을 가르치는 그들의 노력에 대한 것입니다. 비디오 애니메이션 그녀의 공헌 아트웍을 셰리 린,, 그리고 마 차나, 제이슨 메커 및 켄드라 마샬 (또한, 우리는 electroporator 전극 공학 Stefanov - 바그너 이스마엘에게 감사를 표합니다 <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) 동영상을 제작. NIDCD에서이 작품은 보조금 (연구 청문회 P30DC05209 - MEEI 코어 지원,, RO1DC007174 첨단 R03DC010065 - 파커)에 의해 재정 지원되었다.

1 일. 살균 및 유리 coverslips의 코팅. <ol><li> 압력솥에 유리 현미경 coverslips을 소독 건조. </li><li> 미리 소독 안경 물론 세포 배양 접시의 두 우물에 살균 coverslips를 놓습니다. </li><li> 코트 1:1 폴리 - L - ornithine과 laminin과 coverslips 4에서 하룻밤 20% 태아 소 혈청 (FBS) ° C.와 보충 <ol class="lalpha"><li> 400 μL 폴리 - L - ornithine (4에 저장된 0.01 % 용액 ° C) </li><li> 400 μL laminin (50 μg / -20 ° C에서 aliquots에 저장된 ML 주식 솔루션) </li><li> 200 μL FBS (-20 ° C에서 aliquots에 저장) </li></ol></li><li> 150 ° C 배양기에서 해부 도구가 하룻밤 사이에 열 소독. </li><li> 10 % 혈청 및 10 MG / ML 암피실린을 포함하는 배지를 확인합니다. <ol class="lalpha"><li> 90 ML Dulbecco의 수정된 이글 매체 </li><li> 5 ML FBS (-20 ° C에서 aliquots에 저장) </li><li> 5 ML 말 혈청 (-20 ° C에서 aliquots에 저장) </li><li> 10 μL 암피실린 (4에 저장된 10 MG / ML 주식 솔루션 ° C) </li></ol></li></ol> 일 2. Corti의 기관의 분리. <ol><li> 긍정적인 흐름 절개 후드를 소독. <ol class="lalpha"><li> 20 분 대한 자외선 설정 </li><li> 70 % 에탄올 모든 표면을 스프레이하고 사용하기 전에 5 분 기다립니다. </li></ol></li><li> 운영 가위를 사용하여 구멍의 매그넘의 기지에 펍 목을 벨 마우스 (P4). </li><li> 간단히 70 % 에탄올을 포함 10cm 접시에 머리를 씻어. </li><li> 메스 블레이드를 사용하여 표피를 제거합니다. </li><li> 메스 블레이드를 사용하여 화살 봉합 따라 두개골을 열고 다음 forebrain를 이등분하다. 자세한 해부를위한 꼬리 forebrain을 유지합니다. </li><li> 무딘 절개를 사용하여 forebrain, 소뇌와 brainstem를 제거합니다. </li><li> 시간적 뼈 (그림 2A)을 제거 70 % 에탄올에 잠시 그​​들을 찍어 및 멸균 HBSS를 포함하는 3mm 요리로 전송할 수 있습니다. </li><li> 포셉를 사용하여 측두 골의 바위 부분에서 불라과 주변 조직을 제거합니다. </li><li> 콘치 모양의 달팽이관을 (그림 2B) 찾아 집게를 사용하여 vestibular 시스템에서 그것을 구분합니다. </li><li> 개발이 단계에서, 뼈에 미로 완전히 calcified되지 않고 쉽게 집게를 사용하여 해부합니다. 기초 끝에 시작 집게를 사용하여 apically 이동주의 분리하여 달팽이관의 골질 미로를 제거합니다. </li><li> 나선형 인대 및 Corti의 부착 기관은 modiolus (그림 2C)의 나선 따라 낫게됩니다. 조심스럽게 집게를 사용하여베이스의 후크 지역에서 나선 인대를 확보하고 apically 이동으로 긴장을 풀기에 의해 Corti의 장기를 제거합니다. </li><li> 기지에서 시작, # 55 고급 집게 (그림 2D)를 사용 Corti의 기관에서 나선 인대를 제거합니다. 마이크로 절연 Corti 감각 상피 (옵션)의 기관니다. </li><li> 두 사용하여베이스 Corti 훅 지역의 장기를 제거 ½ CC의 인슐린 주사기를 영구적으로 부착 U - 100 28G ½ 집게로 바늘로. </li><li> 꼭대기에서 시작, 내부 세포의 행에서 나선형 limbus를 제거하고 (그림 2E - F) basally 진행합니다. Corti explant의 오르간을 도금 </li><li> 문화의 우물에서 poly-L-ornithine/laminin/FBS 솔루션을 제거하고 배지 130 μl를 추가합니다. </li><li> 잘와 동양 문화의 코팅 유리 coverslip 세포의 속눈썹가 가리키고되도록 explant에 Corti의 해부하는 기관을 전송합니다. </li><li> 물론 200 μL 피펫을 사용하여 문화 매체를 제거합니다. 두개골 기저부의 멤브레인가 코팅된 유리 coverslip와 고체 접촉을하게되었는지 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 200 ML의 피펫을 사용하여 Corti의 기관에 배지 130 μL를 추가합니다. Corti의 장기의 표면에 두 방울을 적용하고 서서히 coverslip 측면에 나머지 볼륨을 추가합니다. Corti의 기관이 coverslip에 부착된 남아있는 문화 미디어 부동하지만,하지 않는지 확인하십시오. </li><li> 37 5 % CO 2의 존재에 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 3 일. Corti의 교양 기관에 리포터 유전자의 Electroporation. <ol><li> Corti 문화의 기관에서 배지를 제거합니다. </li><li> 1 분 130 μL H 2 O를 추가하고 다음 200 μL 피펫을 사용하여 제거합니다. </li><li> 플라스미드 DsRed 기자 (-20 ° C에 저장된 2mg / ML H 2 O) 30 μL를 추가합니다. </li><li> 있도록 micromanipulator를 사용하여 electroporator의 전극을 양극 사전차 음극은 문화의 양쪽에있다. </li><li> Corti explant 문화의 기관에 기자의 유전자를 electroporate하는 펄스를 (27V, 30 MS 기간, 10 펄스 트레인) 생성. <ol class="lalpha"><li> 옵션 : modiolar과 explant의 나선 인대의 양쪽에 transgene의 electroporation을 위해 펄스의 극성을 반대로. </li></ol></li><li> 5 분 기다립니다. </li><li> DNA 용액 (2 부품 DNA 3 부품 Fugene) Fugene 6 130 μL를 추가합니다. 이 솔루션은 이전 층류 후드에 3 ML 라운드 바텀 폴리스티렌 테스트 튜브를 사용하여 electroporation 절차의 시작 (단계 20) 준비를해야합니다. 이 솔루션을 만들려면 : <ol class="lalpha"><li> 테스트 튜브에 Opti - 멤 (4 ° C에 저장된)의 2.4 μL를 추가합니다. </li><li> 테스트 튜브에 Fugene 6 시약의 0.6 μL (4 ° C에 보관)을 추가합니다. Opti - 멤에 직접 Fugene을 추가하고 테스트 튜브의 측면과 직접적인 접촉을 피하기 위해 있는지 확인하십시오. </li><li> 일초에 대한 와동. </li><li> 실온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 2.0 μL DsRed 기자 플라스미드 DNA를 두 번 좌초 (100 μg의 DNA / ML H 2 O의 aliquots에서 -20 ° C에 보관)을 추가합니다. </li><li> 일초에 대한 와동. </li><li> 실온에서 15 분 알을 품다. </li><li> 문화 매체 200 μL를 추가합니다. </li><li> 일초에 대한 와동. </li></ol></li><li> ° C 5 % CO 2에서 37 밤새 품어. </li><li> 잘 문화 2 ML 문화 매체를 추가하고 37 ° C에 대해 10 일 최대 품어. </li></ol> 대표 결과 우리는 perinatal 마우스 Corti의 기관의 분리를위한 방법을 제시한다. 절차는 뼈에 미로가 충분히 절개가 성가신 렌더링 calcified되고있는 시점에서, 출생 후의 일에 대해 최대 16 일 배아처럼 젊은 쥐 6 사용할 수 있습니다. Corti의 장기를 해부되면, 그것은 하나의 전체 (그림 3)이나 마이크로 절연 감각 상피 (그림 4)로 도금과 교양 수 있습니다. 우리는 더 Corti의 교양 기관에서 외인성 유전자를 표현하는 기술을 제시했습니다. organotypic 문화는 RT - PCR이나 원위치 하이브리드화에서 마이크로 분리를 사용하여 나선 신경절 세포 또는 외인성 줄기 세포와 함께 Corti 공동 문화의 기관을 사용하여 Corti 유전자 표현의 기관의 분석과 같은 연구의 많은 다른 유형을 위해 유용합니다 3 또는 머리 세포 죽음과 재생의 체외 분석 인치 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" /></a> 그림 1. Corti의 P4 murine 기관의 크로스 섹션을 참조하십시오. (A) P4 마우스에서 얻은 cryosectioned 달팽이관의 기초 설정에서 단면이 프로토콜에 설명된 murine 달팽이관의 일반적인 구조를 보여줍니다. 스칼라 미디어가 옆으로 vascularis 나선 인대와 선에 의해 경계이며, Reissner S 멤브레인 위에, 나선형 limbus medially, 그리고 inferiorly 두개골 기저부의 막. 상자 B에 확장 영역이 (B) Corti의 기관은 두개골 기저부의 막의 우수한 측면에 위치하고 있으며 내부 세포, 외부 세포의 세 행, 그리고 각각 지원하는 세포 중 하나 행을 포함 지적했다. 점선 1 Corti의 해부의 기관 중에 제거되는 두개골 기저부의 멤브레인 따라 위치를 나타냅니다. 점선 2 마이크로 절연 절차 중에 제거되는 두개골 기저부의 멤브레인 따라 위치를 나타냅니다. 녹색 나선형 limbus의 치간 세포, 달팽이 세포, 나선 신경절의 뉴런뿐만 아니라 나선 인대 7 vascularis 선의 세포를 라벨 calbindin의 immunohistochemical 레이블을 나타냅니다. 핵의 DAPI 라벨은 파란색입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" /></a> 그림 2. Corti의 해부 하이라이트의 기관의 동반 비디오에서 Corti의 해부의 기관. 이미지) 격리 측두 골의 (적색) 이내에있는 달팽이관과 vestibular 시스템, B) 달팽이관의 골질 미로, C) 나선 인대와 연결을 뼈다귀 미로, D의 제거 후 Corti의 기관) 나선형 인대의 제거 및 선 vascularis (적색) Corti, E의 기관에서) 나선 limbus (적색)에서 감각 상피의 미세 분리하고, F) 격리 나선형 limbus (왼쪽)와 감각 상피 (오른쪽). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="그림 3" border="0" /></a> 그림 3. 의 장기를 보여주는 Corti explant의 교양 기관. DIC 이미지설명한대로 5 일간, 절연 도금 및 교양 P4 Atoh1 - nGFP 마우스의 Corti. 프로 헤어 세포 유전자에게 무조의 상동체 1 (Atoh1 일명 Math1)를 표현 세포 핵 8화된되는 녹색 형광 단백질을 전시 있도록이 마우스는 유전자 조작되었습니다. 이 생쥐에서 Corti의 기관은 모든 머리 세포 핵에서 핵 GFP 레이블을 전시하므로 epifluorescent 현미경을 사용하여 감각 상피 쉽게 시각화를위한 수 있습니다. 비교적 큰 소용돌이 limbus는 감각 상피로 측면을 볼 수 있습니다. Corti의 기관에서 유래했습니다 Mesenchymal 세포는 explant 떨어져 마이 그 레이션했습니다. 블루 핵 레이블은 DAPI입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="그림 4" border="0" /></a> 그림 4. 마이크로 절연 감각 상피. 설명 및 야간 교양 등 Corti의 P4 murine 기관으로부터 격리되어 감각 상피에서 얻은 Epifluorescent 이미지. 마이크로 분리는 다음 4 % paraformaldehyde에 고정하고 달팽이 세포를 라벨 마이 오신의 7A의 immunolabeling에 대한 처리되었습니다. 그림 3에서 비교적 큰 소용돌이 limbus의 부재를 적어 둡니다. 블루 핵 레이블은 DAPI입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="그림 5" border="0" /></a> 그림 5. Corti의 교양 기관에 DsRed 리포터 유전자의 Electroporation. P4 Atoh1 - nGFP 마우스 새끼에서 Corti의 전체 장기가 고립되었습니다, 도금 후 epifluorescent 현미경으로 설명하고 볼로 DsRed 리포터 유전자로 electroporated. 유전자 변형 DsRed 기자 단백질을 표현 Corti의 explant의 기관의 세포는 감각 상피 전시 녹색 형광 핵의 붉은 형광과 내생 세포를 나타냅니다. 형질 세포는 나선형 limbus과 감각 상피를 통해 볼 수 있습니다.

<ol>
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이 절차의 성공을 위해 중요한 몇 가지 세부 사항이 있습니다. 측두 골의 절연에서 Corti 보육, 장기 이식 문화의 coverslip 및 결과에 연결할 수있는 큰 기회의 기관에 짧은 시간. 따라서, 해부 및 보육에 장기 배치 사이의 시간의 양을 제한하는 것이 중요합니다. 많은 aminoglycoside의 항생제가 ototoxic하고 헤어 세포 죽음을 초래하기 때문에 항생제의 선택도 중요합니다. 그것이 모두 항생제의 사용을 ...없이 지내다 것이 바람직하지만, 이것은 오염에 대한 가능성을 엽니다 떠납니다. 따라서, 우리는 잠재적인 오염 문제를 극복하기 위해 일반적으로 10 μg / ML 암피실린의 사용을 권장합니다. 이 대부분의 성가신 측면, 그리고 Corti의 기관의 기본 문화에 대한 다른 절차가 부화하는 동안 접시를 부동으로 장기 경향이있다. 부동 장기 문화가 5~7일 결혼은 남아있을 수 있지만, culturing 부동 장기의 단점이있다. 예를 들어, 현미경은 문제가 렌더링 4-5일 후 자신에 자주 배 부동 기관 문화. coverslip에 부착된되었습니다 장기에 비해 이후, 장기의 구조적 무결성이 손상 될 수 있습니다. 우리는 다음과 같은 기술이 Corti의 기관은 문화 미디어 부동하지 않도록하는 데 도움이 발견했지만 coverslip에 부착된 남아 있습니다. 첫째, 1시 1분 polyornithine / laminin에 코팅 유리 coverslips는 설명 20% FBS와 함께 보충. 이 프로토콜에 대한라고 하룻밤 배양은 접시를 코팅해야한다는 최소한의 시간입니다. 저희 연구실에서는, 우리는 종종 우리는 코트 1 주일에 필요한 4에서 그들을 유지하는 것이 접시의 모든 ° 우리가 하룻밤 배양을위한 인큐베이터로 이동할 때 C는 날까지 전에 사용할 수 있습니다. 세포의 속눈썹가 얼굴 있도록 둘째, 장기 방향은, 코팅 coverslips에 explant를 이송 후. 이 오리 엔테이션은 문화 접시에 두개골 기저부의 막의 부착을 용이하게합니다. 셋째, explant의 코팅 접시에 부착하기 위해 잘 내에서 미디어를 제거합니다. 이것은 문화 요리와 두개골 기저부의 멤브레인 사이의 접촉을 보장하고 유리에 준수하는 explants의 능력을 향상시킬 것입니다. 이것은 세포의 행 구조적 무결성을 유지하는 도움이 될 것입니다. 마지막으로, 신중하게 200 μL 용량 피펫을 사용하여 Corti의 장기의 표면에 배지 2 방울 드립 후 서서히 coverslip의 측면에 남아있는 볼륨 (총 130 μL의) 흘리지하여 잘 입력합니다. 코팅 coverslip에 Corti의 기관의 첨부 파일을 보장하기 위해 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. explants의 부화에 절개의 개시에서 그것은 일반적으로 Corti 격리 절차의 기관을 완료하려면 연습 운영자 10 분 걸립니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 Corti의 기관의 나선 limbus에서 감각 상피의 마이크로 - 절연을위한 방법을 제시한다. 이 절차에서는 나선 limbus는 28G를 사용하여 감각 상피에서 떨어진 해부 있습니다 ½ 인슐린 바늘 해부 도구로. 마이크로 분리를 발생하는 세포 및 해당 지원하는 세포 (그림 3)의 행으로 구성되어 있습니다. 이 프로토콜에서 설명한대로 격리 감각 상피 그때 교양 수 있습니다. 이 마이크로 절연 절차는 조직 4 주변에서 감각 상피 조직의 효소 분리에 비해해야합니다. 예 닭, 지하 mesenchymal 세포 4 감각 상피 조직의 격리 격리된 vestibular 장기 결과의 thermolysin 소화 등 포유류에서뿐만 아니라 비 포유 동물 종. 쥐 달팽이관에서 큰 상피 능선의 분리, 낮은 상피 리지와 지하 막 5 동반 감각 상피 조직의 thermolysin의 소화 결과. 그러나, 그것은 달팽이 감각 상피가 함께 mesenchymal 세포없이 코팅 접시에 첨부할 수 있는지 확실하지 않다. 기계적 마이크로 절연 방식과 나선 limbus에서 감각 상피 조직의 분리 효소 소화 방법 결과, thermolysin의 소화를 통해 마이크로 분리 절개의 장점을 모두 비교적 짧은 프로토콜, 저렴 시약, 그리고 잠재적으로 덜 스트레스를 포함하는 동안 소화 효소의 효과로 인해 explant. 또한, 지하 막는 문화 판에 감각 상피의 첨부 파일을 향상시킬 수있는,이 접근법에 그대로 남아 있습니다. 이 방법의 단점이 섬세한 해부와 마이크로 절개로 인한 감각 상피 잠재적인 기계적 손상에 대한 기술을 개발 할 필요가 있습니다. 이 절차의 유틸리티의 예를 들어, 우리는 또한 기관의 사용 중 한 예를 제시Corti 문화, explant 문화에 외인성 유전자의 electroporation. 위에서 설명한 electroporation 절차는 Corti의 electroporation의 기관의 이전 방법에 따라 달라집니다. 특히, 청 그리고 가오 (2000)은 explants는 아가로 오스의 성형 홈으로 electroporation을 위해 장소에서 개최하고 콜라겐에 대한 혈청이없는 배지 2 코팅 8 잘 LabTek 슬라이드 도금 아르 Corti의 절연 쥐 기관의 electroporation을 설명합니다. 그들의 접근 방식의 장점은 장기가 explants의 상단 표면 이론적 explant 전체 electroporated 세포도 분포가 발생해야하는 음극을 얼굴 있도록 방향이다. Corti의 기관이이를 electroporation 후 explant의 조작을 줄이는 절차 전반에 걸쳐 coverslip에 부착된 남아 있기 때문에 우리의 손에 그러나 우리가 설명하는 방법은이 절차를 개선. 또한, Corti의 장기의 높은 비율이 제시 방법을 사용하여 coverslips에 붙어 있었다. 우리의 방법은 존스, 외. (2006) electroporation 후 유전자 발현의 효율성을 높일 수있는 Fugene 6 시약의 추가를 사용하여에서 가져옵니다. 존스 외. (2006) 프로토콜에서는, 장기는 100 Fugene 6 transfection 시약의 μL, 그리고 도금 6 5 분 incubated, electroporated 있습니다. 우리의 방법은 우리가 최소한의 장기 독성과 최적의 형질 표현을 제공하기 위해 경험적으로 발견 플라스미드 DNA에 Fugene 6 시약의 3시 2분 비율의 사용 다릅니다. 우리는 문화에 독성을 초래할 수있는, undiluted Fugene 6 시약을 사용하지 마십시오. 우리 프로토콜에서 전극 구성뿐만 아니라 나선 limbus 또는 음극의 위치에 따라 감각 상피 중의 기본 유전자 발현의 존스 외. (2006) 결과. 음극에 먼 문화의 측면에 DsRed 긍정적인 세포가 있지만, 가까이 음극으로 유전자 변형 세포의 높은 농도가있다. Corti explant의 기관의 양쪽에있는 transgene의 완전한 표현을 보장하기 위해, 현재 단순히 반전 연결에 의해 두 번째 펄스 열차 되돌릴 수 있습니다. Corti (그림 5)의 장기에 걸쳐 transgene의 강력한 표현의 표시 프로토콜 결과입니다.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

모든 포유 동물에서 오디션에 대한 감각 상피는 내이 (内耳) (그림 1)의 콘치 모양의 달팽이관 내에있는 Corti의 나선형 기관을 따라 위치하고 있습니다. 청각 시스템의 mechanosensory 세포의 개발 달팽이관,의 세포는 하나 내부 세포의 행 세 (기본 중반 전환)을 네 가지 (혀끝의 차례로) 외부 세포의 행에 정렬됩니다 그 Corti의 기관의 길이에 걸쳐. 세포는 두뇌가 해석할 수있는 신경 자극으로 두개골 기저부의 막의 사운드 유도된 기계적 진동을 transduce. 감각 청각 손실의 대부분은 달팽이 세포의 사망이나 장애로 인해 발생합니다. 청각 연구에 점점 더 필수적인 도구가 고립되고 장기 explant 1,2,9의 체외 문화 인치 일단 격리, explants는 정보에 관한 규범, 변칙, 또는 치료 생리를 제공하기 위해 여러 가지 방법으로 활용 수 있습니다. 유전자 발현, stereocilia의 운동성, 세포 및 분자 생물학뿐만 아니라 머리 세포 재생을위한 생물 학적 접근 Corti의 explants의 기관의 실험 응용 프로그램의 예입니다. 이 프로토콜은 신생아 생쥐에서 Corti의 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 함께 비디오 마우스 새끼에서 측두 골의 격리를 위해 stepwise 방향과 달팽이관, 나선 인대, 그리고 Corti의 기관의 후속 고립을 포함합니다. 일단 고립, 감각 상피는 도금과 전체 체외에서 교양, 또는 추가로 해부 나선 limbus하고 나선 신경절의 뉴런이 부족되는 마이크로 - 분리. 수 있습니다 이 방법을 사용하여 기본 explants은 70~10일에 대한 유지하실 수 있습니다. 이 절차의 유틸리티의 예를 들어, Corti의 explants의 기관은 외인성 DsRed 리포터 유전자로 electroporated 것입니다. 그것은 고립, microdissection, 그리고 Corti의 기관의 주요 문화, 재현성 모호하지 않은, 그리고 stepwise 방향을 제공하기 때문에이 방법은 다른 방법을 통해 출판 향상을 제공합니다.

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Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

25.8K 조회수.  Harvard Medical School. 이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

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Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Mycobacteria의 Electroporation

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

연구

생물학

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.