In This Article

Summary

Ten artykuł opisuje protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w laboratoryjnym bioreaktorze zawiesinowym 3D.

Abstract

Pochodzenie komórek linii neuronalnej z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) było kamieniem milowym w badaniach nad mózgiem. Od czasu ich pierwszego pojawienia się, protokoły są stale optymalizowane i są obecnie szeroko stosowane w badaniach i opracowywaniu leków. Jednak bardzo długi czas trwania tych konwencjonalnych protokołów różnicowania i dojrzewania oraz rosnące zapotrzebowanie na wysokiej jakości hiPSC i ich neuronowe pochodne zwiększają potrzebę przyjęcia, optymalizacji i standaryzacji tych protokołów do produkcji na dużą skalę. W niniejszej pracy przedstawiono szybki i skuteczny protokół różnicowania genetycznie zmodyfikowanych, indukowanych doksycykliną neurogeniny 2 (iNGN2) hiPSC do neuronów przy użyciu laboratoryjnego trójwymiarowego (3D) bioreaktora zawiesinowego.

Krótko mówiąc, jednokomórkowe zawiesiny iNGN2-hiPSC mogły tworzyć agregaty w ciągu 24 godzin, a zaangażowanie linii neuronalnej zostało wywołane przez dodanie doksycykliny. Agregaty zostały zdysocjowane po 2 dniach indukcji, a komórki zostały albo kriokonserwowane, albo ponownie posiane w celu końcowego dojrzewania. Wygenerowane neurony iNGN2 wcześnie wykazywały ekspresję klasycznych markerów neuronalnych i tworzyły złożone sieci neurytyczne w ciągu 1 tygodnia po ponownym posiewie, co wskazuje na rosnącą dojrzałość kultur neuronalnych. Podsumowując, przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku do szybkiego generowania neuronów pochodzących z hiPSC w środowisku 3D, który ma ogromny potencjał jako punkt wyjścia do modelowania chorób, fenotypowych wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności na dużą skalę.

Introduction

Zaburzenia neurologiczne są główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie1. Dotyczy to jednej na sześć osób, a liczba zachorowań stale rośnie. Związane z tym obciążenie finansowe dla społeczeństw i ich systemów opieki zdrowotnej jest ogromne. Ocena 30 krajów europejskich w 2010 r. oszacowała roczne koszty związane z zaburzeniami psychicznymi i neurologicznymi na 800 mld euro2. Rosnące obciążenie społeczno-ekonomiczne wymaga skutecznych strategii leczenia i chociaż nasza wiedza na temat patofizjologii chorób znacznie wzrosła, przełożenie na kliniki jest często niewystarczające. Ogólnie rzecz biorąc, tylko 12% farmaceutyków wchodzi do badań klinicznych, z czego ponad 80% kończy się niepowodzeniem na późniejszych etapach, głównie z powodu nieskuteczności lub nieprzewidzianej toksyczności3,4. Powody są różne, ale ograniczona możliwość przejścia z testów na zwierzętach w fazach przedklinicznych do badań na ludziach coraz częściej wysuwa się na pierwszy plan5. Ludzkie modele komórkowe i tkankowe in vitro mogą wypełnić lukę w translacji międzygatunkowej, a postępy w technologii pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka (hiPSC) mają ogromny potencjał w tym zakresie. hiPSC są szeroko stosowane w badaniach podstawowych i mają wspólne zasadnicze cechy z embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC), takie jak prawie nieograniczona zdolność do samoodnawiania się i zdolność do różnicowania się we wszystkie trzy listki zarodkowe 6, przy jednoczesnym obejściu problemów etycznych związanych z niszczeniem zarodków.

Uzyskanie komórek nerwowych z hESC, a później hiPSC, było kamieniem milowym w badaniach nad mózgiem. Początkowe protokoły różnicowania opierały się na zastosowaniu czynników wzrostu naśladujących krytyczne etapy podczas embriogenezy, z których większość obejmowała podwójne hamowanie SMAD w zawiesinie lub hodowlach przylegających7,8,9. Dojrzałe neurony zostały z powodzeniem wygenerowane, ale kilka wad tych protokołów nadal utrudnia ich szerokie zastosowanie w opracowywaniu leków, takich jak niska wydajność i duża zmienność generowanych neuronów między partiami, a także duże obciążenie pracą związane z długim czasem hodowli. Poprawę osiągnięto dzięki wymuszonej ekspresji czynników transkrypcyjnych krytycznie zaangażowanych w neurogenezę, a członkowie rodziny neurogenin (NGN), w szczególności NGN2, zostali zidentyfikowani jako skuteczne sterowniki10. Ektopowa ekspresja NGN2 w hiPSC za pośrednictwem lentiwirusa znacznie przyspieszyła wczesne etapy różnicowania neuronów i indukowała los komórek neuronalnych w ciągu zaledwie 1 tygodnia11. Późniejsze końcowe dojrzewanie w kokulturach z astrocytami dało funkcjonalne neurony o wysokiej czystości i ilości o powtarzalnych właściwościach. Następnie zastosowano ukierunkowaną na miejsce edycję genów locus bezpiecznej przystani miejsca integracji wirusa związanego z adenowirusem 1 (AAVS1) w celu utworzenia linii hiPSC ze stabilną i indukowaną doksycykliną kasetą ekspresyjną dla NGN212,13, minimalizując w ten sposób niepożądane skutki uboczne dostarczania lentiwirusa.

Solidne i efektywne różnicowanie neuronów neurogeniny 2 (iNGN2) indukowanych doksycykliną ma ogromny potencjał dla wysokoprzepustowych fenotypowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności10,14,15; a w ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w bioprzetwarzaniu, wdrażając bioreaktory do skalowalnej ekspansji i różnicowania komórek16,17,18,19. Jednak większość protokołów różnicowania jest zoptymalizowana pod kątem kultur przylegających, a translacja na środowisko trójwymiarowe (3D) często wymaga niezbędnych modyfikacji. Ostatnio doniesiono o udanym zastosowaniu laboratoryjnego bioreaktora 3D o zredukowanych cechach naprężeń ścinających do ekspansji hiPSC i powtarzalnego różnicowania na hepatocyty, kardiomiocyty i neurony20. W tym przypadku przedstawiono szczegółowy protokół generowania i charakterystyki neuronów iNGN2 przy użyciu identycznego laboratoryjnego bioreaktora 3D.

Protocol

UWAGA: Wszystkie manipulacje komórkami, jak również naczynia hodowlane i preparaty z pożywką, powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. Okap z przepływem laminarnym należy dokładnie wyczyścić przed użyciem i po przetworzeniu, przecierając wszystkie powierzchnie 70% etanolem. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem różnicowania neuronów w inkubatorze i bioreaktorze CERO 3D (zwanym dalej bioreaktorem laboratoryjnym). Ten bioreaktor stołowy oferuje cztery szczeliny na specjalistyczne probówki bioreaktora, każda o maksymalnej pojemności 50 ml. Temperatura i poziom CO2 są stale kontrolowane, a parametry uprawy (np. prędkość obrotowa i czas) są regulowane dla każdej rury niezależnie. Wszystkie etapy aspiracji zostały wykonane przy użyciu pipety aspiracyjnej i pompy próżniowej, o ile nie zaznaczono inaczej.

1. Hodowla i ekspansja hiPSC

UWAGA: W tym protokole używana jest indukowana doksycykliną linia hiPSC NGN2 BIONi010-C-13. Podany tutaj protokół ekspansji jest zoptymalizowany pod kątem 6-centymetrowych szalek Petriego, ale w razie potrzeby można użyć alternatywnych formatów hodowli.

  1. Pokryć 6 cm szalki Petriego matrycą błony podstawnej rozcieńczoną w zimnym zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM)/F12 (-/-) firmy Dulbecco w końcowym stężeniu 0,083 mg/ml/10 cm2. Inkubować panierowane naczynia w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut
    UWAGA: Szczegółowy protokół przygotowania roztworu matrycy do membrany podstawnej można znaleźć w instrukcji producenta. hiPSC mogą być hodowane na alternatywnych matrycach zewnątrzkomórkowych w celu ekspansji.
  2. Rozmrażanie kriokonserwowanych hiPSC zgodnie z Protokołem użytkownika linii komórkowej EBiSC 21 w pożywce konserwacyjnej iPSC bez zasilania + inhibitor 10 μM ROCK (Y-27632). Zalecana jest gęstość wysiewu 1 × 106 żywotnych komórek na szalkę 60 mm.
  3. Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę konserwacyjną iPSC bez podawania bez inhibitora ROCK i wykonuj codzienne zmiany pożywki.
  4. Rozpocznij pasażowanie, gdy kultury hiPSC osiągną zbieżność 60%-80%. Sprawdź, czy nie ma zróżnicowanych obszarów i wyczyść kolonie ręcznie, jeśli obszar przekracza 5%.
    UWAGA: Niezróżnicowane hiPSC pojawiają się jako okrągłe komórki z wyraźnym jąderkiem i mniejszą ilością cytoplazmy. Płaskie i ciasno upakowane kolonie powstają wcześnie po rozmrożeniu lub pasażowaniu. Przykładowe obrazy kultur hiPSC w jasnym polu przedstawiono na stronie Rysunek 1. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w Protokole użytkownika linii komórkowej EBiSC21. Do pasażowania należy przygotować naczynia pokryte matrycą membrany podstawnej i pożywkę konserwacyjną iPSC bez podajnika.
  5. Odessać pożywkę z kultur hiPSC i przepłukać komórki 2x 0,5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) bez Ca2+ i Mg2+ (DPS [-/-], patrz Tabela materiałów).
  6. Usunąć supernatant i dodać 2 ml 0,5 mM EDTA w 1x DPBS (-/-) do 6 cm szalek Petriego. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty w inkubatorze.
  7. Odessać 1,5 ml roztworu EDTA i kontynuować inkubację przez 3-5 minut.
  8. Delikatnie postukaj w naczynia, aby ułatwić odłączenie komórek.
    UWAGA: Sprawdź odłączenie za pomocą oceny wizualnej. Kolonie hiPSC powinny zacząć odrywać się po 5 minutach, ale może być wymagany dłuższy czas inkubacji w przypadku bardziej zlewających się kultur hiPSC. Jeśli kolonie nie oderwą się, wydłuż czas inkubacji do 10 minut, ale nie przekraczaj tego czasu.
  9. Dodać 5 ml pożywki do konserwacji iPSC bez podawania na 6-centymetrowe szalki Petriego i delikatnie zawiesić kolonie 2x za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml lub za pomocą końcówek do pipet o szerokim otworze. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: hiPSC są bardzo wrażliwe na naprężenia mechaniczne; W związku z tym należy unikać wielokrotnego zawieszania. Ostateczna zawiesina komórek powinna składać się z małych fragmentów kolonii (50-200 μm).
  10. Odessać supernatant z powlekanych szalek hodowlanych i przygotować 4 ml pożywki do konserwacji iPSC bez podajnika na 6 cm naczynie.
  11. Przenieść małe fragmenty kolonii do świeżo przygotowanych szalek hodowlanych w proporcjach 1:10 do 1:40 i uprawiać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 z codzienną zmianą pożywki.
    UWAGA: Małe kolonie powinny przyczepić się w ciągu 1 lub 2 godzin po pasażu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Morfologia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych hodowli komórek macierzystych. (A,B) Dobrej jakości kultury hiPSC o różnym konfluencji, pokazujące zwarte kolonie hiPSC o jednorodnej morfologii i zdefiniowanych krawędziach. (C) hodowla hiPSC z pojawiającymi się skupiskami zróżnicowanych komórek wokół krawędzi kolonii (przerywana biała linia). Podziałka = 200 μm. Skrót: hiPSC = ludzka indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wstępna hodowla hiPSC w systemie bioreaktora laboratoryjnego (dzień-2)

UWAGA: Rozpocznij wstępną uprawę, gdy kultury hiPSC osiągną konfluencję między 60% a 80%. Sprawdź kolonie hiPSC pod kątem zróżnicowanych obszarów. Podczas tej fazy wstępnej hodowli hiPSC są utrzymywane w pożywce pielęgnacyjnej iPSC bez karmienia przez 2 dni.

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną składającą się z pożywki podtrzymującej iPSC bez podawania i inhibitora 10 μM ROCK (Y-27632).
  2. Całkowicie odessać pożywkę z hiPSC i delikatnie przepłukać komórki dwukrotnie 1x DPBS (-/-).
  3. Dodać 2,0 ml podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA do 6 cm szalek Petriego i inkubować komórki przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
  4. Delikatnie postukaj w naczynia, aby ułatwić oderwanie komórek, lub inkubuj przez 1-2 minuty dłużej.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki konserwacyjnej iPSC + inhibitora ROCK na miskę. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml i delikatnie wymieszać przez pipetowanie, aby zapewnić pojedynczą izację komórek.
  6. Określ liczbę komórek w 100 μl zawiesiny komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, jak opisano wcześniej20. Przenieść odpowiednią objętość dla 15 × 106 komórek na probówkę bioreaktora do probówki o pojemności 50 ml.
  7. Odwirować komórki w temperaturze 300 × g przez 3 minuty.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki podtrzymującej iPSC + inhibitora ROCK.
  9. Napełnij każdą probówkę o pojemności 50 ml 18 ml pożywki (gęstość wysiewu komórek 0,75 × 106 komórek/ml). Dozuj zawiesinę komórkową do probówek bioreaktora (20 ml na probówkę).
  10. Umieść rurki w systemie bioreaktora. Ustaw następujące parametry uprawy: okres obrotu 2 s, prędkość obrotowa 60 obr./min, brak przerwy na mieszanie, 37 °C i 5% CO2 na nieograniczony czas20.
  11. Uruchom program uprawy za pomocą wyświetlacza bioreaktora.
  12. Zmień nośnik następnego dnia. Pozwól agregatom osiąść w probówkach bioreaktora przez ~5 minut. Ostrożnie odessać supernatant.
    UWAGA: Nie pozwól, aby agregaty osiadały dłużej niż 10 minut, ponieważ mogą sklejać się ze sobą i tworzyć niejednorodną zawiesinę kruszywa. Zaleca się pozostawienie ~5 ml pożywki hodowlanej w probówce bioreaktora.
  13. Dodać 15 ml świeżej, bezpodajnej pożywki do konserwacji iPSC bez inhibitora ROCK na probówkę i kontynuować uprawę w bioreaktorze laboratoryjnym przez 24 godziny.

3. Różnicowanie hiPSC we wczesnych neuronach (dzień 0)

  1. Przygotowanie podłoża neurobazalnego (NBM): 50% DMEM/F-12 ze stabilizowanym dipeptydem L-alanylo-L-glutaminy, 50% podłoże neurobazalne, 0,5x suplement bez surowicy (50x), 0,5x suplement bez surowicy na bazie preparatu N-1 Bottensteina (100x), 0,5x stabilizowany dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy, 0,5x roztwór aminokwasów endogennych MEM (100x), 500 nM pirogronian sodu (100 mM), 50 nM 2-merkaptoetanol (50 mM), 0,025% roztwór insuliny ludzkiej, i 5 U/ml penicyliny-streptomycyny.
    UWAGA: NBM musi być przechowywany w temperaturze 4 °C i może być używany do 2 tygodni.
  2. Różnicowanie neuronów należy rozpocząć od dodania doksycykliny (DOX) do kultur hiPSC. W tym celu pozwól agregatom osiąść w rurach bioreaktora. Ostrożnie odessać supernatant z komórek, pozostawiając ~5 ml w probówce, i dodać 35 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM) składającej się z NBM i 2 μg/mL DOX.
    UWAGA: Ponieważ DOX jest wrażliwy na światło, zaleca się wyłączanie światła podczas pracy.
  3. Umieść probówki z powrotem w bioreaktorze stołowym i kontynuuj uprawę.
  4. Wykonuj zmiany nośników codziennie przez 2 dni, zgodnie z opisem w kroku 3.2.
    UWAGA: Po 4 dniach w hodowli zawiesinowej agregaty można zdysocjować, a wczesne neurony poddać krioprezerwacji lub bezpośrednio ponownie platerować w celu końcowego dojrzewania.

4. Kriokonserwacja wczesnych neuronów (dzień 2)

UWAGA: Kriokonserwacja nie jest wymagana i nie jest krytyczna dla procesu różnicowania, ale wysoce zalecana, ponieważ duże zapasy wczesnych neuronów mogą być produkowane i przechowywane do późniejszego dojrzewania i analiz.

  1. Pozwól agregatom osiąść w rurze bioreaktora. Odessać supernatant zgodnie z wcześniejszym opisem.
  2. Przenieść agregaty do sterylnej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml i delikatnie przepłukać agregaty 2x 1x DPBS (-/-). Ostrożnie zassać supernatant tak bardzo, jak to możliwe, nie naruszając agregatów.
  3. Dodać 2-5 ml wstępnie podgrzanego enzymu dysocjacji komórek, w zależności od wielkości osadu, i inkubować komórki przez około 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Delikatnie zawieszaj osadzone agregaty co 2 minuty, aż do dysocjacji agregatów.
    UWAGA: Prawie jednorodną zawiesinę komórkową należy uzyskać po 7-10 minutach inkubacji.
  4. Dodaj potrójną objętość podgrzanego podłoża NBM i ostrożnie ponownie zawieś komórki, aby zapewnić pojedynczą jedność komórek.
  5. Określ liczbę komórek i przenieś odpowiednią objętość do kriokonserwacji do probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml.
    UWAGA: Zalecana jest gęstość komórek 5-10 × 106 komórek/ml pożywki do zamrażania.
  6. Odwirować komórki w temperaturze 300 × g przez 3 minuty.
  7. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki zamrażającej zawierającej 10% dimetylosulfotlenku (DMSO).
  8. Podwielokrotną zawiesinę komórkową umieścić w odpowiednich fiolkach do kriokonserwacji (1 ml/fiolkę).
  9. Natychmiast przenieść fiolki do wstępnie schłodzonego, wolno zamrażającego pojemnika wypełnionego 2-propanolem i umieścić pojemnik w temperaturze -80 °C na noc. Następnego dnia umieścić fiolki w temperaturze -150 °C w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Płynny 2-propanol jest wysoce łatwopalny i może spowodować uszkodzenie oczu w kontakcie. Przechowywać z dala od źródeł ciepła i nosić rękawice ochronne oraz okulary.

5. Dojrzewanie neuronów pochodzących z hiPSC w kulturach jednowarstwowych

  1. Przygotuj naczynia hodowlane pokryte poli-L-ornityną/lamininą do długotrwałej hodowli neuronów pochodzących z hiPSC.
    1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy poli-L-ornityny do 0,001% w 1x DPBS (-/-) i obtoczyć naczynia przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Odessać roztwór poli-L-ornityny i raz umyć płytki 1x DPBS (-/-).
    2. Rozcieńczyć roztwór lamininy w 1x DPBS (-/-) do końcowego stężenia 10 μg/ml i inkubować szalki przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Objętość 0,1-0,15 ml nacm2 jest zalecana dla procedur powlekania i 0,2 ml nacm2 dla wszystkich odpowiednich etapów prania. Można stosować alternatywne podłoża powłokowe, ale należy ocenić potencjalny wpływ na przyleganie i dojrzewanie komórek.
  2. Rozmrozić kriokonserwowane komórki. W tym celu należy umieścić kriowial w łaźni wodnej (ustawionej na 37 °C) i obracać go przez około 1 minutę, aż pozostanie niewielka grudka zawiesiny zamrożonych komórek.
  3. Ostrożnie przenieść zawiesinę komórek kroplami do probówki o pojemności 15 ml przygotowanej z 10 ml wstępnie podgrzanego NBM. Przepłukać kriowial 1 ml NBM i przenieść zawiesinę komórek do identycznej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować komórki z natężeniem 300 × g przez 3 minuty.
  5. Odessać supernatant i dodać 1-2 ml NIM uzupełnionego 10 μM inhibitorem ROCK.
  6. Ostrożnie zawiesić osad komórek i określić liczbę komórek.
  7. Odessać pozostały roztwór lamininy z powlekanych szalek do hodowli komórkowych i wysiać komórki o gęstości wysiewu 1 × 105 komórek/cm2 w NIM uzupełnionym 10 μM inhibitorem ROCK.
  8. Po 24 godzinach zmienić podłoże na NIM bez inhibitora ROCK.
  9. Wykonuj codzienne zmiany pożywki przez 4 dni.
  10. Po tej początkowej fazie indukcji NGN2 należy pominąć DOX i hodować komórki w NBM, ze zmianami połówkowymi 2x w tygodniu, aż do osiągnięcia pożądanego etapu dojrzewania.
    UWAGA: Współhodowla neuronów iNGN2 z astrocytami jest zalecana w celu zwiększenia przeżywalności, przywiązania, dojrzałości i aktywności elektrycznej komórek13,22.

6. Charakterystyka neuronów pochodzących z hiPSC

UWAGA: Różnicowanie na pochodne neuronalne można ocenić za pomocą następujących technik.

  1. Immunocytochemia i obrazowanie
    1. Odessać pożywkę z neuronów pochodzących z hiPSC i przemyć komórki raz 1x DPBS z Ca2+ i Mg2+ (+/+).
      UWAGA: Pipetować ostrożnie, najlepiej na krawędziach studzienki, ponieważ komórki mogą bardzo łatwo oderwać się od powierzchni. Objętość 0,2 ml nacm2 jest zalecana dla wszystkich etapów mycia, aby zapewnić całkowite pokrycie komórek 1x DPBS (+/+).
    2. Utrwalić komórki nerwowe za pomocą roztworu utrwalającego zawierającego 4% paraformaldehydu w DPBS (+/+) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Zalecana jest objętość 0,1 ml nacm2.
      UWAGA: Paraformaldehyd (4%) w DPBS jest niebezpiecznym i drażniącym skórę roztworem o ostrej toksyczności i potencjalnej rakotwórczości. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, nosić rękawice i okulary ochronne, unikać wdychania i używać roztworu tylko w przewiewnym środowisku.
    3. Delikatnie spłucz komórki 2x w 1x DPBS (+/+) i przystąp do barwienia.
      UWAGA: Stałe ogniwa można przechowywać w DPBS (+/+) w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca do czasu dalszej obróbki.
    4. Odessać DPBS (+/+) z próbek. Przepuszczalność komórek i zablokowanie niespecyficznych miejsc wiązania za pomocą 1x DPBS (+/+) zawierającego 1% BSA i 0,2% Triton-X-100 przez 60 minut w RT.
      UWAGA: Zalecana jest objętość 0,2 ml nacm2.
    5. Usunąć supernatant i inkubować komórki przez noc w temperaturze 4 °C, z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w buforze barwiącym (1x DPBS [+/+] zawierający 1% BSA) (patrz tabela materiałów). Upewnij się, że komórki są całkowicie pokryte roztworem.
      UWAGA: Zalecana jest objętość 0,1-0,15 ml nacm2.
    6. Odessać bufor barwiący i przepłukać komórki 3x w 1x DPBS (+/+).
    7. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (patrz tabela materiałów) w buforze barwiącym o końcowym stężeniu 1:1 000.
    8. Inkubować komórki w rozcieńczonym roztworze przeciwciał przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Upewnij się, że komórki są całkowicie pokryte roztworem.
      UWAGA: Zalecana jest objętość 0,1-0,15 ml nacm2.
    9. Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przepłukać komórki 2x w 1x DPBS (+/+).
    10. Wybarwić przeciwbarwić jądra 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI), rozcieńczonym w DPBS (+/+) przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Zalecana jest objętość robocza 0,1-0,15 ml nacm2.
    11. Wypłucz komórki 2x w 1x DPBS (+/+).
    12. Przechowywać komórki w DPBS (+/+) w temperaturze 4 °C do momentu obrazowania.
      UWAGA: Obrazowanie w jasnym polu jest odpowiednie do śledzenia zmian morfologicznych i przerostu neurytów. Ponadto stereotypową ekspresję markerów można ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Podczas gdy niezróżnicowane hiPSC wyrażają OCT 3/4 i NANOG, beta-III-tubulina (TUBB3) i białko związane z mikrotubulami 2 (MAP2) mogą służyć jako markery neuronalne do wizualizacji neurytów i aksonów. Sieć neuronytyczną można dodatkowo ocenić, określając długość neurytów w jasnym polu lub obrazach fluorescencyjnych.
  2. Analiza ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR)
    1. Odessać pożywkę i przepłukać komórki raz w 1x DPBS (-/-).
      UWAGA: Zalecana jest objętość 0,2 ml nacm2.
    2. Dodaj zimny bufor do lizy RNA i zbierz komórki, drapiąc.
    3. Wyizolować RNA za pomocą odpowiedniego zestawu opartego na kolumnach i oznaczyć stężenia RNA za pomocą fotospektrometrii UV.
    4. Wygeneruj cDNA przy użyciu 250 ng całkowitego RNA i odpowiedniego zestawu do odwrotnej transkrypcji.
    5. Przygotować molekularne reakcje qPCR zawierające 2,5 ng cDNA w dwóch egzemplarzach. Użyj odpowiedniej mieszanki wzorcowej i odpowiednich testów startera20 (patrz Tabela materiałów).
    6. Uruchomić qPCR, stosując 45 cykli z wyżarzaniem gruntującym w temperaturze 60 °C przez 20 s.
    7. Normalizuj względne poziomy ekspresji genów do średniej genów porządkowych GAPDH, HPRT1 i GUSB. Zastosuj metodę ΔΔCt23, używając niezróżnicowanych hiPSC jako kalibratora.

Results

Podczas początkowych etapów, przylegające kultury hiPSC są odłączane, pojedyncze i przenoszone do zawiesiny (Rysunek 2). Agregaty powstają w ciągu 24 godzin i stale rosną w swoich rozmiarach. Po 2 dniach indukcji transgenu wczesne neurony można poddać kriokonserwacji do kolejnych eksperymentów.

Uporczywe rozprzestrzenianie się w pierwszych dniach w zawiesinie powoduje wzrost liczby komórek, osiągając swój szczyt po 2 dniach indukcji (Rysunek 3A,B). Wraz z rozprzestrzenianiem się agregaty zaczynają rosnąć. W porównaniu z dniem 0, średnica wykazuje wzrost o 50% w dniu 2 i jest prawie podwojona w dniu 5 (Rysunek 3D). Chociaż rosnąca średnica ogranicza dopływ składników odżywczych do wnętrza agregatów, żywotność komórek nie ulega zmianie w 2 lub 5 dniu różnicowania (Rysunek 3C). Jednak długotrwała hodowla przez ponad 4 dni w zawiesinie nie poprawia dalszej wydajności komórek, ponieważ agregaty stają się coraz bardziej odporne na singularyzację enzymatyczną (Rysunek 3B).

Po krioprezerwacji, komórki dnia 2 są rozmrażane i powlekane na naczyniach pokrytych poli-L-ornityną (PLO) w celu końcowego dojrzewania. Ogólnie rzecz biorąc, komórki bardzo dobrze przyczepiają się po rozmrożeniu i wcześnie zaczynają się rozszerzać neuryty. Czasowy profil ekspresji genów, a także barwienie immunocytochemiczne markerów neuronalnych TUBB3 i MAP2, potwierdzają tożsamość komórek neuronalnych (Figura 4A, B). Oprócz rosnących poziomów TUBB3 i MAP2, kultury neuronalne są wzbogacone w transkrypty tau białka związanego z mikrotubulami (MAPT), kodujące białko neuronalne zaangażowane w stabilizację aksonów i wykazują jednoczesny spadek ekspresji czynnika transkrypcyjnego regulującego pluripotencję POU5F1. Co więcej, gęsta sieć neuronowa tworzy się w ciągu pierwszego tygodnia po rozmrożeniu (Rysunek 4C). Te zmiany morfologiczne, w połączeniu z profilem transkrypcyjnym, sugerują rosnące dojrzewanie kultur neuronalnych.

figure-results-1
Rysunek 2: Generowanie neuronów iNGN2 pochodzących z hiPSC przy użyciu bioreaktora stacjonarnego. (A) Schematyczny przegląd paradygmatu różnicowania, podkreślający kluczowe etapy hodowli komórek. (B-F) Obrazy w jasnym polu wizualizują (B) hiPSC i (C,D) tworzenie się agregatów w bioreaktorze laboratoryjnym. (E,F) Neurony iNGN2 wydłużają neuryty i ulegają zmianom morfologicznym podczas różnicowania. Podziałka = 100 μm. Skróty: BMM = macierz błony podstawnej; iPSC-MM = podłoże konserwacyjne iPSC; PLO = poli-L-ornityna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Wydajność i żywotność komórek podczas tworzenia i wzrostu agregatów. (A) Obrazy w jasnym polu przedstawiają tworzenie się agregatów w ciągu 2 dni od hodowli w bioreaktorze laboratoryjnym, a także wzrost wielkości agregatu w czasie. Podziałka liniowa = 500 μm. (B) Kwantyfikacja wydajności komórek i (C) żywotność w przebiegu różnicowania. Wykresy słupkowe reprezentują średnią + SD z czterech niezależnych eksperymentów. (D) Średnica, wskazująca na wielkość agregatów, została określona półautomatycznie przy użyciu oprogramowania open source ImageJ (wersja 1.53). Najpierw obrazy w jasnym polu zostały przekształcone w obrazy binarne, a następnie poddane dalszej ocenie za pomocą narzędzia do analizy cząstek, stosując następujące parametry: rozmiar > 2500 μm2, okrągłość 0,45-1, wykluczenie krawędzi i uwzględnienie otworów. Linie poziome wskazują średnią ± SD pięciu niezależnych różniczek. Pojedyncze kropki reprezentują średnią z indywidualnych eksperymentów różnicowania z co najmniej 20 agregatami na punkt czasowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Charakterystyka neuronów iNGN2 pochodzących z hiPSC. Czasowy profil ekspresji genów dla genów neuronalnych TUBB3, MAP2 i MAPT, a także genu POU5F1 związanego z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Względne poziomy ekspresji zostały znormalizowane do genów referencyjnych GAPDH, HPRT1 i GUSB. Jako kalibrator wybrano niezróżnicowane hiPSC (dzień-2). Symbole geometryczne wskazują średnią ± SD czterech niezależnych różniczek. (B) Reprezentatywne obrazy neuronów iNGN2 w 7 dniu po rozmrożeniu (dzień-2 + 7), wybarwionych na beta-III-tubulinę (TUBB3, magenta) i białko związane z mikrotubulami 2 (MAP2, cyjan). Jądra komórkowe podbarwiono przeciwwagowo za pomocą DAPI. Podziałka = 100 μm. (C) Ocena sieci neuronowej w obrazach kultur neuronalnych w jasnym polu po rozmrożeniu. Całkowitą długość neurytów określono w obszarze od 930,82 × 698,11μm2 za pomocą ImageJ (wersja 1.53). Po dostosowaniu jasności i kontrastu obrazy zostały przekonwertowane na obrazy 8-bitowe, a kolory zostały odwrócone. Neuryty zostały następnie zeszkieletowane, a następnie przeanalizowane za pomocą wtyczek ImageJ odpowiednio "Skeletonize" i "Analyze Skeleton". Całkowita długość neurytów została podzielona przez liczbę somy w obszarze zainteresowania, aby uzyskać średnią długość neurytów na komórkę. Wykresy słupkowe reprezentują średnią + SD z trzech niezależnych eksperymentów. Skróty: DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Wcześniej wykazano, że ektopowa ekspresja neuronalnego czynnika transkrypcyjnego NGN2 przyspiesza wczesne etapy różnicowania neuronów i indukuje zaangażowanie linii neuronalnej w hiPSC w ciągu 1 tygodnia od hodowli 12,13,20. W niniejszej pracy opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC BIONi010-C-13 z edytowanymi genami w neurony iNGN2 przy użyciu bioreaktora laboratoryjnego.

Bioreaktor CERO 3D to bioreaktor o małej objętości z czterema szczelinami na specjalistyczne rurki, każda o maksymalnej pojemności 50 ml. Temperatura i poziom CO2 są stale kontrolowane, a parametry uprawy (np. prędkość obrotowa i czas) są regulowane dla każdej rury, niezależnie umożliwiając użytkownikom równoległe stosowanie kilku podejść do różnicowania. Zintegrowane łamacze fal na wewnętrznej ściance rury pozwalają na zakłócenia medium przy niskim naprężeniu ścinającym i utrzymują agregaty 3D w zawieszeniu podczas kontrolowanego obrotu. Ograniczony dostęp do składników odżywczych, a także wymuszone interakcje 3D komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), mogą znacząco wpływać na różnicowanie i zachowanie komórek 24,25,26,27.

Hodowla komórek jako agregatów 3D w zawiesinie zwiększa te interakcje komórkowe, naśladując w ten sposób bardziej zbliżone środowisko in vivo tkanek lub narządów28. Jednoczesne zaburzenie ośrodka reguluje wielkość agregatu pod wpływem tarcia mechanicznego, poprawia wymianę gazową i zmniejsza gradient składników odżywczych i odpadów w rurze, zachowując jednocześnie fizjologicznie odpowiednie gradienty wewnątrz agregatów 29,30,31,32,33,34. Chociaż zmiany podłoża są wykonywane ręcznie, bioreaktor laboratoryjny zmniejsza koszty pracy i eksploatacji w porównaniu ze statycznymi kolbami hodowlanymi. Bioreaktor ma również kilka zalet w porównaniu z w pełni zautomatyzowanymi bioreaktorami z mieszadłem, ponieważ konstrukcja bez wirnika zmniejsza hydrodynamiczne naprężenia ścinające na powierzchni agregatu, poprawiając w ten sposób nie tylko przeżywalność komórek, ale także ograniczając wpływ naprężeń ścinających na wrażliwe iPSC, różnicowanie komórek i funkcję 35,36,37,38.

Bioreaktory z kołem pionowym, w których komórki są mieszane przez duży wirnik pionowy, a także bioreaktory z ruchem kołysanym wykorzystujące napompowane worki hodowlane przymocowane do platformy z napędem silnikowym, stanowią alternatywne platformy zawieszenia 3D. Chociaż nadmiernie przetestowano je pod kątem hodowli hiPSCs 17,18,19,39,40, niewiele wiadomo na temat ich zastosowania w podejściach do różnicowania neuronów, a doniesienia ograniczają się do udanej ekspansji neuronalnych komórek prekursorowych ssaków i ludzi w bioreaktorach z mieszadłem 41,42,43,44 , przy czym nieliczna liczba badań koncentrowała się na dojrzewaniu44,45. Ogólnie rzecz biorąc, zautomatyzowane platformy zawieszenia 3D mają tę zaletę, że są w pełni zautomatyzowane i sterowane komputerowo zmiany medium, zmniejszając w ten sposób różnice w obsłudze i minimalizując ryzyko zanieczyszczenia. Ponadto parametry składników odżywczych, takie jak stężenie mleczanu i glukozy, mogą być stale monitorowane. Jednak stworzenie tych systemów często wymaga znacznych inwestycji początkowych, powierzchni laboratoryjnej i przeszkolenia wykwalifikowanego personelu. Bioreaktor laboratoryjny stanowi kompaktową i łatwą w użyciu alternatywę do hodowli komórek w zawiesinie, ale nie zapewnia jednoczesnego monitorowania składników odżywczych.

Podobnie jak w przypadku większości protokołów stosowanych do hodowli komórek na platformach zawiesinowych 3D, początkowe formowanie agregatów stanowi krytyczny krok. hiPSC są hodowane jako przylegające monowarstwy, a następnie przenoszone jako zawiesiny jednokomórkowe do środowiska 3D. Aby zminimalizować utratę komórek na tym etapie, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Konstrukcja probówek ze zintegrowanymi łamaczami fal oznacza, że wymagana jest minimalna objętość hodowli wynosząca 10 ml na probówkę, aby zapewnić optymalne zakłócenia medium. W związku z tym w perspektywie długoterminowej nie należy podcinać krytycznego wolumenu. Ponadto wysoce zalecana jest początkowa gęstość wysiewu wynosząca 7,5 miliona komórek na 10 ml objętości kultury i prędkość obrotowa 60 obr./min w celu utworzenia stabilnych agregatów w krótkim okresie, chociaż adaptacje mogą być konieczne w zależności od linii komórkowej.

Po przeniesieniu hiPSC do zawiesiny, w ciągu 24 godzin powinny powstać agregaty. Pierwsza zmiana podłoża jest krytyczna, ponieważ agregaty są małe i mogą nie osiadać prawidłowo. Czas sedymentacji agregatów może być wydłużony, ale nie powinien przekraczać więcej niż 10 minut, ponieważ agregaty mogą zacząć zbijać się w bryły i rosnąć w niejednorodny sposób. Podczas aspiracji w probówce należy pozostawić minimalną objętość kultury wynoszącą 5 ml i unikać wszelkich zakłóceń pożywki. Niemniej jednak w początkowych fazach należy spodziewać się utraty komórek i agregatów. Liczba komórek wskazuje na stałą wydajność komórek w ciągu pierwszych 2 dni w hodowli, co wskazuje, że wysoka zdolność proliferacyjna hiPSC kompensuje początkową utratę komórek. Po zawieszeniu, delikatna uprawa i perturbacja prowadzą do powstania agregatów o jednorodnej wielkości, które z czasem zaczynają rosnąć.

Różnicowanie neuronów przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem opartym na nadekspresji NGN2 indukowanej doksycykliną13, a poszczególne etapy zoptymalizowano pod kątem hodowli 3D. Neuronalny czynnik transkrypcyjny NGN2 jest dobrze opisanym czynnikiem różnicowania neuronów i znacznie przyspiesza indukcję neuronów 11,13,46. Podczas gdy konwencjonalne wzorce ze zdefiniowanymi czynnikami wzrostu trwają od kilku tygodni do miesięcy 7,8,9, ekspresja NGN2 indukuje los komórek neuronalnych w ciągu kilku dni. Oprócz skróconego czasu uprawy, protokół nie zależy ani od drogich czynników wzrostu, ani od matryc powlekających dla początkowej kultury zawiesinowej, co dodatkowo obniża koszty uprawy.

Co więcej, bezpośrednie porównanie napędzanej przez NGN2 generacji niedojrzałych neuronów w kulturach adherentnych i zawiesinowych wykazało 1,36-krotny wzrost liczby komórek po 4 dniach hodowli przy użyciu bioreaktoralaboratoryjnego 20, podczas gdy oczekuje się, że objętość pożywki potrzebna do wytworzenia 1 miliona komórek zostanie zmniejszona o połowę. Wykorzystanie bioreaktora stacjonarnego do generowania neuronów iNGN2 może być zatem korzystne, ponieważ można wyprodukować większą liczbę komórek przy krótszym czasie i kosztach obsługi. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, zaangażowanie linii neuronalnej zaobserwowano na wczesnym etapie. Po 2 dniach indukcji NGN2 widoczna była głęboka ekspresja klasycznych markerów neuronalnych, takich jak TUBB3, MAP2 i MAPT, co potwierdza możliwość zastosowania bioreaktora laboratoryjnego do indukcji neuronów. Zgodnie z tym protokołem, około 6,2 miliona niedojrzałych neuronów iNGN2 można uzyskać z 1 miliona hiPSC w ciągu 4 dni od hodowli. Jednak wydajność wyjściowa może się różnić w zależności od partii i zależeć od objętości kultury zawiesinowej podczas siewu.

Aby jeszcze bardziej zwiększyć plon, czas uprawy został wydłużony o dodatkowe 3 dni; Jednakże, chociaż agregaty stały się większe, stały się również bardzo zwarte i nie mogły być prawidłowo oddzielone w celu kriokonserwacji lub ponownego powlekania. Pomimo postępów w podejściu do hodowli 3D, przylegające hodowle neuronów 2D są nadal złotym standardem w analizach funkcjonalnych, takich jak układy mikroelektrod lub obrazowanie wapnia. Singularyzacja komórek jest zatem ważnym warunkiem wstępnym dla jednorodnie rozmieszczonej monowarstwy neuronalnej i sieci neuronalnej. Silniejsze mechaniczne oderwanie komórek lub ostre odczynniki dysocjacyjne mogą być stosowane w celu zapewnienia singularizacji, ale z potencjalnym wpływem na żywotność komórek, fizjologię i zdolność ponownego przyłączenia47,48. Jeśli chodzi o konieczność posiadania pojedynczych komórek do dalszych analiz i dojrzewania, agregaty zostały zdysocjowane po 4 dniach w zawiesinie, a neurony iNGN2 (dzień 2) uległy krioprezerwacji. Różnicowanie i charakterystyka neuronów iNGN2 po rozmrożeniu potwierdziły rosnącą dojrzałość kultur neuronalnych i tworzenie się gęstej sieci neuronowej.

Dostarczony protokół daje dużą liczbę neuronów iNGN2. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Podobnie jak w przypadku większości platform do hodowli zawiesinowych, przeniesienie hiPSC z hodowli przylegającej 2D do środowiska 3D ma kluczowe znaczenie i często wiąże się z głęboką utratą komórek. Oczekuje się dalszych znacznych strat komórek i agregatów podczas zmian pożywki. W porównaniu z platformami zautomatyzowanymi, czas obsługi i ryzyko zanieczyszczenia przy użyciu bioreaktora stołowego są wydłużone, ponieważ wymiana medium musi być wykonywana ręcznie. Oprócz braku automatyzacji, bioreaktor laboratoryjny nie oferuje możliwości monitorowania składników odżywczych, a maksymalna pojemność 50 ml na probówkę ogranicza potencjał skalowania protokołu. Na koniec ważne jest, aby zauważyć, że chociaż NGN2 przyspiesza zaangażowanie linii neuronalnej, czas dojrzewania końcowego nie ulega skróceniu i nadal wymaga długotrwałej hodowli przez kilka tygodni. Biorąc pod uwagę znaczenie wsparcia astrocytarnego dla funkcji neuronów, przywiązania i przeżycia 49,50,51, należy rozważyć podejścia oparte na kokulturze, które mogą być nawet niezbędne do długoterminowej hodowli.

Podsumowując, protokół różnicowania 2D został z powodzeniem przeniesiony do środowiska 3D w celu szybkiego i powtarzalnego generowania neuronów iNGN2 poprzez wdrożenie bioreaktora stacjonarnego. Opisany protokół pozwala na uzyskanie dużej ilości dobrej jakości neuronów pochodzących z iPSC, które mogą służyć jako punkt wyjścia do złożonych testów modelowych, wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności na dużą skalę.

Disclosures

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

Projekt EBiSC2 otrzymał dofinansowanie od Wspólnego Przedsięwzięcia (JU) Inicjatywy Leków Innowacyjnych (JU) na podstawie umowy o grant nr 821362. Wspólne Przedsięwzięcie otrzymuje wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" oraz EFPIA. Dziękujemy Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters i Vanessie M. Nalewaja za pomoc w analizach immunocytochemicznych i ekspresji genów, a także Heike Arthen za doskonałe wsparcie techniczne. Ponadto dziękujemy Stephanie Bur za stworzenie programu bioreaktorów. Rysunek 2A został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-merkaptoetanol 50 mMGibco 
60 mm Nunclon Delta SurfaceNunc734-2040
Przeciwciało tubulinowe anty-beta III [TU-20] (rozcieńczenie 1:1,000)Abcam   AB7751 
Biosystemy stosowane  Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo Fisher Scientific   
Suplement B-27 (50x) Gibco11530536suplement bez surowicy (50x)
BIONi010-C-13 linia hiPSCEuropejski Bank dla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (EBiSC), BIONEER jako deponentSAMEA103988285Bioneer jest deponentem w EBiSC i właścicielem linii hiPSC.
Biorender 
Klasa hodowli komórkowej BSAThermo Fisher Scientific   
Inkubator CERO 3D & BioreaktorOLS OMNI Life Science2800000
CEROtubes Probówki do hodowli komórkowych 50 mLOLS OMNI Life Science2800005
Citavi 6Swiss Academic Software
CryoStor CS10Stemcell7930pożywka zamrażająca zawierająca 10% DMSO
Cytofix Fixation SolutionBD Biosciences 554655roztwór utrwalający zawierający 4% paraformaldehydu 
DAPI (BARWIENIE UTRWALONYCH KOMÓREK NUCBLUE) Thermo Fisher Naukowy   
Chlorowodorek doksycykliny (DOX)Sigma-AldrichD3447
DPBS bez wapnia i magnezu (DPBS -/-) Gibco14190250
DPBS z Wapniem i Magnezem (DPBS +/+) Gibco11580456
DMEM/F12 (-/-)Gibco21331-020
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXGibco31331-028
EVOS XL System obrazowania komórek rdzeniowychThermo Fisher Scientific
Goat anty-mysie IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific   A21424
Suplement GlutaMAX Gibco 35050-038stabilizowany dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy
ImageJ 1.51v National Institute of Health
Roztwór insuliny ludzkiSigma-AldrichI9278l
LamininMerckL2020
MACSQuant AnalyzerMiltenyi
MAP2 Przeciwciało monoklonalne (rozcieńczenie 1: 300)Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Zredukowany czynnik wzrostu, bez czerwieni fenolowej Nauki przyrodnicze Corning 356231matryca błony podstawnej
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Gibco 
11140035 Zestaw optycznych folii samoprzylepnych MicroAmp Thermo Fisher Naukowy   
mTeSR1Stemcell85850bezfeederowe podłoże do konserwacji iPSC 
Suplement N-2 (100x)Gibco17502-048bez serum Suplement na bazie Bottensteina s Preparat N-1
Neurobasal MediumGibco11570556
Nikon Eclipse TS2Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200ChemoMetec A/S
Pochodzenie 2021OriginLab
Penicylina-StreptomycynaGibco11548876
Bufor do trwałej ondulacji/płukania BD Nauki Biologiczne 
Test podkładowy TUBB3(Hs00801390_s1)Test podstawowy Thermo Fisher Scientific11620099
Test podkładowy GAPDH (Hs99999905_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
GUSB (Hs99999908_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Test gruntowy HPRT1 (Hs99999909_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
podkładowy MAP2 (Hs00258900_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Test podkładowy MAPT (Hs00902194_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Test wstępny POU5F1 (Hs04260367_gH)Thermo Fisher Scientific11620099
Poli-L-ornityna 0,01%MerckP4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-ZestawQiagen74034Zestaw do izolacji RNA oparty na kolumnie
Bufor RLTQiagen79216Bufor do lizy komórek
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco12539059
StemPro AccutaseGibco11599686enzym dysocjacji komórek
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIXThermo Fisher Scientific   11380912qPCR master mix
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787
TrypLE Select EnzymGibco12563-011Roztwór trypsyny-EDTA
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher ScientificAM9260G
KasetaVia1 ChemoMetec A/S941-0012
Filtrowane końcówki do pipet o szerokim otworzeThermo Fisher Naukowe10088880
X20 OPTYCZNE 96-DOŁKOWE SZYBKIE PRZEZROCZYSTE PŁYTKI REAKCYJNE Thermo Fisher Scientific15206343
dichlorowodorek Y-27632, inhibitor kinazy Rho (inhibitor ROCK)Abcamab120129
1152892610400745Biorender.com123300231233355310095714554723Test gruntowy Test gruntowy Test Test podkładowy

References

  1. Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
  2. Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
  3. Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review. , Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016).
  4. van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
  5. van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  7. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252(2013).
  10. Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240(2021).
  13. Shih, P. -Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386(2021).
  14. Chang, C. -Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000(2000).
  15. Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
  16. Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
  17. Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
  18. Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
  19. Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55(2021).
  20. Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
  21. User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC. , Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023).
  22. Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  25. Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
  26. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
  29. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
  30. Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
  31. Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
  32. Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
  33. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  34. Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
  35. Liu, N., Zang, R., Yang, S. -T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
  36. Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
  37. Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
  38. Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53(2011).
  39. Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
  40. Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
  41. Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
  42. Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
  43. Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
  44. Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82(2009).
  45. Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431(2020).
  46. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  47. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  48. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
  49. Allen, N. J. Astrocyte regulation of synaptic behavior. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 439-463 (2014).
  50. Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L. Why are astrocytes important. Neurochemical Research. 40 (2), 389-401 (2015).
  51. Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24(2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ludzka neurogenina 2indukowane pluripotencjalne kom rki macierzysteIPSCtr jwymiarowy bioreaktorr nicowanie neuron wwysokoprzepustowe badania przesiewowewydajno kom rekzmienno partiiEuropejski Bank Indukowanych Pluripotencjalnych Kom rek MacierzystychKardiomiocytyPre hodowlaRoztw r trypsyny EDTAOdwarstwienie kom rekInhibitor ROCKPo ywka bez zasilaniaSystem bioreaktora