Branża terapii komórkowej i genowej była świadkiem wykładniczej ekspansji w ciągu ostatnich dwóch dekad. Istnieje jednak duża luka technologiczna między badaniami laboratoryjnymi a wytwarzaniem umiejętności przemysłowych. Zgodnie z polityką regulacyjną i aby sprostać ekologicznym wymaganiom branży CGT, do produkcji terapii komórkowych zastosowano zautomatyzowane systemy zamknięte.
W przypadku komórek adherentnych hodowla z użyciem mikronośników w skalowalnych bioreaktorach z mieszadłem jest obiecującą metodą. Konwencjonalnie skomercjalizowane mikronośniki nie są pożądane. Pobieranie komórek za pomocą trypsynizacji i odsiewanie mikronośników według wielkości jest nie tylko nieefektywne i trudne, ale także wpływa na jakość komórek i powoduje obawy dotyczące bezpieczeństwa.
W tym badaniu udało nam się osiągnąć produkcję komórek na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne mikronośniki 3D TableTrix klasy GMP w zautomatyzowanym i zamkniętym systemie. Ponad 11 miliardów ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych uzyskano w dwuetapowej ekspansji w ciągu dziewięciu dni. Wykazaliśmy również wysoką gęstość hodowli komórek HEK293T i komórek Vero, w których obie gęstości osiągnęły ponad 10 milionów komórek na mililitr.
Ta zaawansowana platforma bioprodukcyjna pozwala na skuteczne namnażanie i całkowite pobieranie komórek adhezyjnych w sposób zautomatyzowany i zamknięty. Nasz protokół daje możliwość zwiększenia wydajności produkcji i udoskonalenia kontroli jakości przy produkcji produktów CGT na skalę przemysłową. Aby rozpocząć, wykonaj dwupunktową kalibrację sondy pH za pomocą sterownika bioreaktora.
Następnie, aby zmontować zbiornik bioreaktora, zainstaluj części, takie jak rury ze stali nierdzewnej i wirniki, na płycie głowicy zgodnie z instrukcjami producenta. Podłącz gotowy do użycia jednorazowy zestaw materiałów eksploatacyjnych do hodowli do odpowiednich części, rurek i portów ze stali nierdzewnej na płycie głównej, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta. Po zmontowaniu zbiornika należy przeprowadzić kontrolę szczelności w pełni zmontowanego zbiornika zgodnie z instrukcjami producenta.
Autoklaw naczynia z zestawem materiałów eksploatacyjnych przy ciśnieniu 15 PSI i 121 stopniach Celsjusza przez 60 minut. Po schłodzeniu naczynia do temperatury pokojowej włóż sondę temperatury do rurki termostudziennej i podłącz monitora, sondy pH i sondy DO ze sterownika do odpowiednich części naczynia. Owiń szczelnie matę grzewczą wokół naczynia.
Zaloguj się do systemu sterownika bioreaktora i wprowadź parametry do systemu zgodnie z instrukcją producenta. Przyspawaj rurkę wylotową na pożywce do rurki C-flex wlotowej na butelce zawierającej 10 gramów wstępnie wysterylizowanych mikronośników W01 dla MSC. Przepompować 500 mililitrów pożywki hodowlanej z worka do przechowywania do butelki z mikronośnikami W01.
Z naczynia bioreaktora z mieszadłem zatrzymaj kontrolę temperatury, pH i tlenu rozpuszczonego, a sterownik bioreaktora tymczasowo i całkowicie dozuje cały PBS z naczynia do butelki na odpady. Przyspawaj jednorazowy moduł filtracyjny do portu w 10-litrowej jednorazowej torbie do przechowywania. Przefiltruj i przenieś kompletną pożywkę MSC bez surowicy do torby do przechowywania.
Ustaw prędkość PUMP1 na 300 obr./min i dozuj jeden litr pożywki z worka na paszę do naczynia. Zatrzymaj pompę i ponownie uruchom temperaturę, pH i rozpuszczony DO zgodnie z instrukcjami producenta. Uszczelnij i odłącz rurkę łączącą worek zasilający z rurką zasilającą.
Przyspawaj rurkę z butelki z rozproszonymi mikronośnikami do rurki zasilającej i przepompuj całą zawartość z butelki do naczynia. Następnie ponownie zawiesić 2,5 razy 10 do 8 hMSC w podłożu bez surowicy i przenieść je do pustej butelki zawierającej wcześniej zawiesinę mikronośnika. Dodaj pożywkę bez surowicy do łącznie 500 mililitrów wewnątrz butelki i wymieszaj zawiesinę komórkową.
Przepompuj całą zawartość butelki do naczynia. Uszczelnij i odłącz rurkę łączącą butelkę z rurką zasilającą, a następnie przyspawaj z powrotem worek do karmienia. Dostosuj ustawienia mieszania w sterowniku, aby zainicjować inokulację komórek do mikronośników.
I skonfiguruj zautomatyzowany system uzupełniania i wymiany pożywki. Przyspawaj jednorazowe worki do pobierania próbek do rurki do pobierania próbek i pobieraj próbki w żądanych punktach czasowych. W czasie pobierania komórek, na sterowniku, ustaw prędkość mieszania na zero, aby mikronośniki mogły się osiąść, i dozuj supernatant do reżimu karmienia, pozostawiając około jednego litra zawiesiny hodowli w naczyniu.
Zespawać worek zawierający 50 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu trawiącego z 500 mililitrami HBSS w celu rozcieńczenia i przepompować cały roztwór do naczynia przez rurkę zasilającą. Ustaw prędkość mieszania w zakresie od 40 do 45 obr./min, aby rozpuścić mikronośniki. Po rozpuszczeniu mikronośników w ciągu 40 do 60 minut, przyspawaj jednorazową trzylitrową torbę do przechowywania do probówki zbiorczej i całkowicie wypompuj zawiesinę komórek.
Włącz system przetwarzania komórek podczas pobierania komórek i zainstaluj jednorazowy zestaw do przetwarzania komórek na urządzeniu zgodnie z instrukcjami producenta. Przyspawać worki z zawiesiną komórkową, buforem do przemywania i pożywką hodowlaną do zestawu. Wprowadź parametry operacyjne i rozpocznij automatyczny proces mycia i ponownego zawieszania.
Pobrać próbkę komórek z komory wirówkowej zgodnie ze wskazaniami systemów przetwarzania komórek w celu obliczenia gęstości komórek. Po zliczeniu dostosuj gęstość komórek do 2 razy 10 do 6 komórek na mililitr, używając kompletnej pożywki bez surowicy. W procesie formulacji komórek w bioreaktorze o pojemności 15 litrów należy użyć buforu do ponownego zawieszenia pobranych komórek.
Przyspawać 250 mililitrów zawieszonych komórek do wypełnienia komórki. Zamontuj jednorazowy zestaw materiałów eksploatacyjnych do napełniania i wykańczania w systemie napełniania ogniw i włącz system chłodzenia wstępnego zgodnie z instrukcjami producenta przed ponownym podwieszeniem ogniw. Postępuj zgodnie z instrukcjami w systemie i ustaw go tak, aby napełniał 30 mililitrów na worek, co daje łącznie 20 worków w zestawie.
Przyspawaj nowy zestaw 20 worków do kriokonserwacji z jednorazowym zestawem materiałów eksploatacyjnych do napełniania i wykańczania, a następnie powtórz napełnianie i zakończenie, aż wszystkie komórki zostaną podzielone. W przypadku hMSC osiągnięto skumulowaną 128-krotną ekspansję przy żywotności komórek powyżej 90% Spożycie glukozy wykazało ujemną korelację z ekspansją komórek, wykazując metabolizm związany ze zdrowym wzrostem komórek. Świeżo zebrane MSCs zachowują klasyczne markery fenotypowe z ponad 95% ekspresją dla markerów dodatnich i mniej niż 2% dla markerów ujemnych.
Kriokonserwowane komórki wykazywały dobrą przyczepność, normalne rozprężanie i typowy kształt wrzeciona ze spiralnym wzrostem po rozmrożeniu i ponownym platerowaniu do kolb 2D. Co więcej, komórki zachowują również zdolność do różnicowania się w linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne. Platforma ta może być również zaadoptowana do hodowli innych komórek zależnych od zakotwiczenia, takich jak komórki HEK293T i Vero.
Po procesie przenoszenia kulek do kulek w 15-litrowym bioreaktorze HEK293T komórki osiągnęły szczytowe stężenie komórek 1,68 razy 10 do 7 komórek na mililitr. Podczas gdy komórki Vero osiągnęły stężenie 1,08 razy 10 do 7 komórek. Oba typy komórek zachowały wysoką żywotność.
