Protokół ten szczegółowo opisuje kluczową metodę dokładnego charakteryzowania i oczyszczania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na jednej platformie, umożliwiając efektywne dalsze zastosowania, takie jak przeszczep komórek macierzystych. Jest to szczególnie istotne dla laboratoriów klinicznych usprawniających testy molekularne i cytogenetyczne poprzez precyzyjne sortowanie pojedynczych komórek zmodyfikowanych lub naturalnych komórek macierzystych. Powszechnie stosowane metody izolacji oczyszczonych populacji komórek macierzystych odnoszą się do technik takich jak separacja immunomagnetyczna, gradient gęstości lub mikroprzepływowe sortowanie komórek.
Technika taka jak sortowanie indeksowe pozwala na powiązanie jej z profilowaniem RNA pojedynczej komórki, które może wyodrębnić informacje transkryptomiczne z każdej posortowanej komórki. Kluczowe wyzwania obejmują utrzymanie jakości próbki, optymalizację warunków hodowli komórkowych, w tym gęstości komórek i żywotności w trakcie i po sortowaniu. Dodatkowo rozważany byłby również wybór odpowiednich rozmiarów dysz dla urządzenia i zapewnienie terminowego dostępu do sortowników.
Protokół ten ilustruje precyzyjny panel barwienia do immunofenotypowania i sortowania pożądanej populacji komórek. Zapewnia ustandaryzowaną jakość próbki, optymalną gęstość żywotności komórek dla sortowania populacji komórek i definiuje eksperymentalne parametry sortowania w oprogramowaniu FACSDiva. Metoda ta umożliwia prostą selekcję i immunofenotypowanie populacji komórek macierzystych wykazujących ekspresję określonych biomarkerów.
Ta prosta platforma umożliwia wydajne sortowanie w oparciu o populację docelową, pomagając i uzyskując oczyszczone próbki do kolejnych zastosowań. Na początek umieść mezenchymalne komórki macierzyste w kolbach T75, 100-milimetrowych szalkach i dwóch 48-dołkowych płytkach do wszystkich eksperymentów. Dodaj 200 mikrolitrów 10% pożywki hodowlanej MSC do dołków 48 płytek dołkowych.
Gdy monowarstwa komórki osiągnie 90% konfluencji, zastąp istniejące pożywki z wyznaczonych studzienek kontrolnych 2% pożywką surowicy. Dodaj pożywki różnicujące o linii adipogennej lub osteogennej do dwóch ostatnich studzienek oznaczonych testem. Tego samego dnia spróbuj sprepsynizować zlewającą się naczynie o średnicy 100 mm i przenieś zawiesinę komórek do dwóch oznaczonych 15-mililitrowych probówek.
Odwirować probówki o stężeniu 300 G przez sześć minut. Następnie odpipetować dwa mililitry odpowiedniego podłoża do probówki kontrolnej i probówki. Umieść luźno zakorkowane probówki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla na 21 dni, z wymianą pożywki co trzy dni.
SHED scharakteryzowano za pomocą standardowych testów immunofluorescencyjnych wykazujących ekspresję wimentyny, filamentów aktynowych i jąder barwionych DAPI. Krótkoterminowe testy wzrostu komórek wykazały zwiększone tempo proliferacji od drugiego do ósmego dnia. Test jednostki tworzącej kolonię i barwienie fioletem krystalicznym potwierdziły zdolność SHED do tworzenia kolonii po 14 dniach.
Aby wybarwić linię adipocytów 2D, dodaj 200 mikrolitrów roztworu przepuszczalnego z zestawu na płytkę. Następnie inkubuj komórki w 200 mikrolitrach roztworu roboczego Oil Red O przez 10 minut. Następnie po usunięciu plamy umyj komórki pięć razy 200 mikrolitrami wody destylowanej.
Aby zabarwić linię osteoblastów 2D, dodaj 200 mikrolitrów 5% świeżego azotanu srebra do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę w świetle ultrafioletowym na godzinę. Inkubować komórki w 200 mikrolitrach 2,5% tiosiarczanu sodu przez pięć minut przed płukaniem wodą destylowaną.
W przypadku kultur 3D najpierw uzyskaj sekcje kriogeniczne kultur granulowanych. Aby zabarwić komórki linii chondrocytów, dodaj od jednego do dwóch mililitrów roztworu myjącego do wysuszonych na powietrzu sekcji. Następnie inkubuj je w roztworze utrwalającym przez 30 minut.
Po umyciu wodą destylowaną umieść komórki w jednym do dwóch mililitrów roztworu barwiącego na 30 minut. Przepłucz komórki trzykrotnie 0,1 zwykłym kwasem solnym przed spłukaniem wodą destylowaną. Po 21 dniach MSCs w warunkach in vitro różnicowały się w adipocyty, osteoblasty i linie kondregenne.
Na początek odwiruj trypsynizowane mezenchymalne komórki macierzyste w stężeniu 300 G przez sześć minut, aby uzyskać osad komórkowy. Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki MSC przed zliczeniem komórek. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową.
Następnie, po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu barwiącyego. W celu przygotowania kontroli kompensacji oznacz siedem probówek FACS jako niebarwione, DAPI, V450, FIT, PE, PerCP Cy5.5 i APC. Następnie przygotuj pojedyncze rurki barwiące do kompensacji i inkubuj je w ciemności przez 30 minut.
Po inkubacji umyj komórki w każdej probówce dwa razy, a kulki jeden raz jednym mililitrem buforu barwiącego. Następnie odwirować zwirowane probówki o sile 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu barwiącego.
Inkubować probówkę DAPI w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie 15-minutową inkubację na lodzie w celu wywołania włączenia barwnika. Dodać pięć mikrolitrów DAPI do zawiesiny i inkubować aż do nabycia. Przygotuj zawiesinę komórek i przeciwciał w pięciu znakowanych probówkach FACS zgodnie z tabelą.
Delikatnie zwiruj rurki przed inkubacją. Następnie umyj każdą probówkę dwa razy jednym mililitrem buforu barwiącego. Odwirować zwirowaną probówkę o stężeniu 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie ponownie zawieś pozostały granulat w 500 mikrolitrach buforu barwiącego. Na początek oznacz dwie nowe probówki FACS jako probówki mieszane pierwsza i druga. Przygotować zawiesinę komórek i przeciwciał zgodnie z podaną tabelą do analizy cytometrii przepływowej.
Po inkubacji probówek przez 30 minut, umyj każdą probówkę dwa razy jednym mililitrem buforu barwiącego. Odwirować zwirowane probówki o stężeniu 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach buforu barwiącego.
Pokryj dołki 48-dołkowej płytki 200 do 500 mikrolitrami FBS i trzymaj przez godzinę. Następnie pipetować od 200 do 500 mikrolitrów pożywki 10% MSC po usunięciu resztek FBS. Aby przygotować próbki do sortowania jednokomórkowego, należy odpipetować jeden mililitr FBS do dwóch nowych probówek FACS.
Zwiń rurki, aby uzyskać równomierną warstwę FBS na wewnętrznej powierzchni tuby. Przygotuj zawiesinę komórek i przeciwciał w mieszanych probówkach pierwszej i drugiej zgodnie z tabelą do eksperymentu sortowania. Następnie inkubuj probówki w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po umyciu buforem barwiącym odwirować probówki o stężeniu 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach buforu barwiącego i inkubuj przez 15 minut w pięciu mikrolitrach DAPI przed sortowaniem. Aby skonfigurować matrycę kompensacyjną, użyj pojedynczych rurek kompensacyjnych plam
.
Kliknij na eksperyment na pasku narzędzi w oprogramowaniu instrumentu. Następnie kliknij Ustawienia wynagrodzeń, a następnie utwórz kontrolki wynagrodzeń. Następnie kliknij niezabarwioną probówkę, a następnie parametry w oknie dialogowym cytometru.
Dostosuj napięcia, edytując wartości dla każdego parametru. Kliknij załaduj na pulpicie nawigacyjnym pobierania, a następnie kliknij nabierz. Przeciągnij bramkę P1 do populacji komórek i zastosuj ją do wszystkich elementów sterujących kompensacją, aby ustawić napięcie i bramkę ujemną dla każdego parametru.
Teraz załaduj pojedyncze rurki do kompensacji plam pojedynczo. Zapisz dane i zapisz je. Wybierz bieżący eksperyment, kliknij go prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Oblicz wartości wynagrodzenia, a następnie połącz i zapisz.
Uruchom mieszaną probówkę i nagraj 10 000 komórek. Ustaw bramki w interesującej populacji, które mają być sortowane za pomocą odpowiedniej strategii bramkowania. Następnie załaduj płytkę zbiorczą do urządzenia i ustaw docelową liczbę komórek w zakresie od 2 500 do 5 000 komórek na studzienkę.
Następnie wybierz maskę czystości sortowania pojedynczej komórki. Zbierz posortowane populacje komórek w urządzeniu do zbierania, trzymając je na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu sortowania. Na koniec przenieś płytki do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla, aby utrzymać kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Wykresy wieloparametrycznej cytometrii przepływowej nie wykazały ekspresji izotypu FITC przeciwciał CD90 FITC. Dodatnia ekspresja markerów CD90 i CD73 oraz ujemna ekspresja CD45 są porównywalne z ich niebarwionymi i FMO kontrolami. Fenotypy immunologiczne wykazały rozkład markerów z jednego z wczesnych pasaży z markerami zalecanymi przez ISCT i CD44, określając populacje rodzicielskie jako MSC.
Szopy z późnym przejściem były używane do sortowania pojedynczych komórek ekspresorów o wysokiej i ciemnej średnicy. Posortowane komórki zebrane na 48-dołkowej płytce wykazywały przyleganie i proliferację, podobnie jak ich populacja rodzicielska. Komórki posortowane po zróżnicowaniu różnicowały się w obecności adipogennych czynników wzrostu.
