Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu, jak funkcjonuje przewód pokarmowy i jak na te funkcje wpływają różne stany patologiczne. Jesteśmy zainteresowani poznaniem odpowiedzi różnych komórek nabłonka jelitowego na różne stany, takie jak infekcje i stany zapalne, otyłość i mutacje genetyczne. Znaczenie swoistości przeciwciał staje się coraz bardziej oczywiste.
Jednak wpływ utrwalania tkanek, konserwacji i standaryzowanych metod barwienia jest niedoceniany w tej dziedzinie. Spójne i solidne barwienie immunofluorescencyjne w dużej mierze zależy od jakości zachowania, przetwarzania i orientacji tkanek, które występują na początkowych etapach gromadzenia danych. Protokół ten zapewnia prostą i skuteczną metodę badania różnych pytań dotyczących biologii i fizjologii komórek jelitowych.
Nasze laboratorium korzysta obecnie z tych protokołów, aby lepiej zrozumieć rolę różnych typów komórek jelitowych w utrzymaniu homeostazy i ograniczaniu stanu zapalnego. Protokół ten umożliwia szczegółową wizualizację wszystkich obszarów jelita myszy w jednym bloku zatopionym w parafinie. Pozwala to zaoszczędzić pieniądze na parafinie i usługach zatapiania parafiny, ilości czasu potrzebnego na sekcjonowanie i odczynników.
Jest również wysoce odtwarzalny przy użyciu różnych przeciwciał. Aby rozpocząć, przymocuj dużą końcówkę pipety P200 do 10-mililitrowej strzykawki i napełnij ją PBS. Za pomocą kleszczy włóż końcówkę strzykawki do otworu odcinka jelita wyizolowanego od myszy poddanej eutanazji.
Przytrzymaj odcinek jelita na strzykawce za pomocą kleszczyków i delikatnie przepłucz z szybkością około 50 mikrolitrów na sekundę, aby usunąć zawartość. Zbierz zawartość jelit do pustej łodzi do ważenia. Następnie połóż mokry segment jelita w linii prostej na pasku suchej etykietowanej celulozowej bibuły filtracyjnej.
Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć jelito wzdłuż linii krezki około 5 milimetrów na raz. Użyj dolnej krawędzi nożyczek lub kleszczy, aby położyć pociętą tkankę płasko na bibule filtracyjnej. Teraz umieść kolejny kawałek bibuły filtracyjnej na segmencie jelita, aby zapobiec jego zwijaniu się lub utracie kształtu podczas utrwalania.
Aby zabezpieczyć chusteczkę na miejscu, zszyj krawędzie bibuły filtracyjnej, unikając zszywania tkanki. Zanurz tkanki w 10% normalnie buforowanej formalinie. Delikatnie wyjmij górny kawałek bibuły filtracyjnej dotykający luminalnej strony jelita.
Użyj kleszczy, aby ostrożnie oderwać jelito od dolnego kawałka bibuły filtracyjnej przed jej wyrzuceniem. Następnie umyj tkankę w PBS trzy razy, aby usunąć formalinę z tkanki. Używając kleszczy o odwrotnym działaniu, podnieś kawałek jelita wzdłuż krótszej krawędzi stroną świetlną skierowaną do góry i obróć kleszcze, aby zwinąć tkankę.
Umieść chusteczkę w łodzi do wysadzania suchym ciężarem. Przytrzymaj tkankę na miejscu za pomocą kleszczy w jednej ręce. Ostrożnie otwórz kleszcze o odwrotnym działaniu i uwolnij tkankę, używając innych kleszczy do usunięcia tkanki z kleszczy o odwrotnym działaniu.
Włóż szpilkę do wycinku w rozmiarze 00 do tkanki. Użyj nożyc do drutu, aby usunąć ostrą końcówkę kołka. Po zrolowaniu wszystkich próbek umieść wszystkie cztery rolki tkanek w tej samej kasecie i włóż kasetę do procesora tkanek.
Na stacji zatapiania umieść niewielką ilość parafiny w formie. Wyjmij cztery szwajcarskie rolki z kasety i umieść je w osobnej formie, układając je tak płasko, jak to możliwe. Dodaj więcej parafiny, aby wypełnić formę.
Przenieś formę na zimną płytę i upewnij się, że wszystkie szwajcarskie bułki leżą płasko na dnie formy. Umieść oznaczoną małą kasetę na formie. Gdy wosk zastygnie, wyjmij blok z formy.
Na początek przygotuj nawilżoną komorę, biorąc duże pudełko na suwak i zdejmując tekturową pokrywę przyklejoną do pokrywy. Umieść wilgotne ręczniki papierowe pionowo u podstawy pudełka na prowadnice, upewniając się, że leżą płasko. Przygotować szkiełko do barwienia przez deparafinowanie, ponowne nawodnienie, pobranie antygenu i mycie.
Wyjmij szkiełko z PBS i zetrzyj nadmiar PBS, omijając tkankę. Za pomocą hydrofobowego pisaka narysuj pudełko wokół tkanki, aby utworzyć barierę. Umieść prowadnicę konturową poziomo na adamp ręczniki papierowe.
Dodaj około 100 mikrolitrów buforu blokującego, aby pokryć tkankę. Zamknij wilgotną komorę i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Następnie delikatnie stuknij roztwór blokujący.
Natychmiast dodaj przygotowany blok myszy na myszy, aby przykryć tkankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Pod koniec inkubacji wyjąć szkiełka z nawilżonej komory i umieścić je bezpośrednio w stojaku na szkiełka zanurzonym w PBS. Następnie usuń slajdy z PBS.
Delikatnie strzepnij nadmiar PBS i umieść je poziomo z powrotem w nawilżonej komorze. Dodaj odpowiednio rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe, które są przedmiotem zainteresowania, aby pokryć tkankę. Po wyjęciu szkiełek z wilgotnej komory delikatnie stuknij pierwotne przeciwciała i umieść szkiełka w stojaku na szkiełka zanurzonym w PBS na pięć minut.
Po wyjęciu szkiełek z PBS i strząśnięciu nadmiaru PBS, umieść je poziomo z powrotem w nawilżonej komorze. Dodać odpowiednio rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe fluorofory lub sprzężone przeciwciała pierwszorzędowe będące przedmiotem zainteresowania, aby pokryć tkankę. Następnie dodaj odpowiednio rozcieńczony hoist bezpośrednio na tkankę przed inkubacją w temperaturze pokojowej w ciemności.
Następnie umieść szkiełka w nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym PBS na pięć minut w ciemności. Usuwaj jeden slajd na raz, pozostawiając pozostałe slajdy zanurzone w PBS w ciemności. Po usunięciu nadmiaru PBS dodaj jedną lub dwie krople pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu do środka tkanki.
Chwyć czyste szkiełko nakrywkowe za krawędzie i powoli opuść je na szkiełko pod kątem 45 stopni. Zaczynając od środka tkanki, delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe dwoma palcami. Przymocuj przeciętą, niefiltrowaną pipetę P200 do końcówki pipety serologicznej podłączonej do próżni.
Podążając za krawędziami szkiełka nakrywkowego, użyj odkurzacza, aby usunąć nadmiar medium montażowego. W nowym pudełku na szkiełka połóż szkiełko poziomo płasko, a następnie pozostaw do wyschnięcia w ciemności w temperaturze pokojowej. Obrazy mikroskopowe wykazały morfologię różnych segmentów jelita i barwienie komórek kubkowych, błony wierzchołkowej, błony bocznej komórek nabłonkowych i jąder.
Barwienie immunofluorescencyjne jelita uwidoczniło wiele różnych przedziałów komórkowych, w tym komórki proliferacyjne, śródmiąższ, domenę lizosomalną i nabłonek.
