Cultura do mouse pulmão embrionário, um sistema para avaliar os mecanismos moleculares de Ramificação

Resumo

Cultura de órgão embrionário de pulmão é um sistema muito útil para estudar interações epitélio-mesenquimais. Ambos epiteliais e mesenquimais procede morfogênese em condições específicas que podem ser facilmente manipulados neste sistema.

Resumo

Especificação de pulmão primordial, assim como morfogênese de ramificação, ea formação de várias linhagens de células pulmonares requer uma interação específica da endoderme pulmão com seu mesênquima circundante e mesotélio. Mesênquima pulmonar tem se mostrado ser a fonte de sinais indutivos para morfogênese de ramificação de pulmão. Epitélio-mesenquimais-mesothelial interações também são fundamentais para morfogênese pulmão embrionário. Cultura de órgão embrionário de pulmão é um sistema muito útil para estudar interações epitélio-mesenquimais. Ambos epiteliais e mesenquimais procede morfogênese em condições específicas que podem ser facilmente manipulados neste sistema (na ausência de influência materna e do fluxo sanguíneo). Mais importante ainda esta técnica pode ser facilmente feito em um serumless, meios de cultura quimicamente definido. Ganho e perda de função pode ser conseguido usando proteínas expressas, vetores virais recombinantes e / ou análise de linhagens de camundongos transgênicos, RNA antisense, bem como knockdown do gene RNA de interferência.

Protocolo

Cultura de órgãos é uma técnica muito útil e versátil para o estudo do gene e expressão da proteína. Estes métodos de cultura ex vivo pode ser usado como preliminar ou em complemento a estudos in vivo.

1. Isolamento Lung embrionárias

1. Cronometrado grávidas ratos são sacrificados no dia postcoitum 11,5 ou 12,5 (E11.5-12.5) pelo CO ₂ narcose acordo com as diretrizes do NIH e OLAW. O animal é colocado em uma câmara de CO ₂ e 100% é introduzido. Depois que o animal está inconsciente o fluxo _de CO ₂ é maior. Morte clínica do animal deve ser assegurada.
2. Todos os passos seguintes devem ser concluídas em condições estéreis em capela de fluxo laminar. O útero é removido as fêmeas grávidas. Para remover o útero do animal, as fêmeas grávidas são colocados em suas costas e pulverizadas com etanol 70%. É feita uma incisão no abdômen, ea pele é removida por puxar a pele para cima, mantendo as patas traseiras do animal. A cavidade peritoneal é aberta eo útero é retirado do animal.
3. O sangue é retirado com água, colocando o útero em um tubo de 50 ml cheio de frio Solução Salina Balanceada Hanks (HBSS), eo tubo é suavemente embalado por 2 minutos.
4. O útero é então colocado em uma placa de Petri sob o microscópio estereoscópico de dissecação, e os embriões liberados do útero por uma incisão na parede uterina usando uma tesoura primavera. Os embriões são colhidos usando uma colher perfurada, e colocado no gelo em uma placa de Petri contendo novas HBSS.
5. Sob o microscópio estereoscópico de dissecação, pulmões embrionárias são dissecados, um por um numa placa de Petri contendo HBSS frio (Figura 1).
6. O pulmão isolado embrionárias é colocado sobre o gelo em uma placa de Petri contendo HBSS usando uma pipeta de transferência estéril.

2. Cultura Lung embrionárias

1. 500 microlitros de 1 mililitro por poço de D-MEM/F-12 suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina é adicionado em um prato de poliestireno Nunclon.
2. A membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch é colocado em cima da mídia. Quando a membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch é colocado em cima da mídia, certifique-se que o lado brilhante é contra a mídia, e é lado áspero para cima.
3. Um pulmão dissecados embrionário é colocado em cima da membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch usando uma pipeta de transferência estéril.
4. A posição de pulmão embrionário é ajustado com o fórceps. Pulmão embrionário colocada no filtro deve ter uma traquéia intacta e ser colocado com a traquéia ter uma posição reta, permitindo assim que todos os pulmões para ter a mesma pressão interna.
5. O prato de poliestireno Nunclon é transferido para a cultura desejada tempo em uma incubadora de células (Figura 2).

3. Materiais

1. Isolamento de pulmão embrionário Whole

1. Timed-grávidas (C57BL6 tipo selvagem ou transgênicos) ratos para ser sacrificado no dia postcoitum 11,5-13,5 (E11.5-13.5).
2. Solução de Hanks salina balanceada (HBSS) (1X), líquido, sem cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, ou sulfato de magnésio. (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Armazenar o HBSS à temperatura ambiente ea 4 ° C após a abertura. Alíquotas e armazenar a penicilina-estreptomicina a -20 ° C.
3. Estereomicroscópio estereoscópico (Leica, Wetzlar, Alemanha).
4. Ferramentas de dissecção incluindo Dumont pinças, tesouras Belas íris (reta), mola Noyes tesoura e uma colher Moria ® (perfurada) (Ferramentas Ciência Fine, Foster City, CA).

2. Cultura Lung embrionárias Whole

1. Modificado Dulbecco Eagle Medium: Mix de nutrientes F-12 (D-MEM/F-12) (1X), líquido, 01:01 Contém L-glutamina, mas nenhum tampão HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Manter o frasco DMEM/F-12 longe da luz (por exemplo, cobertas por folhas de alumínio) e armazenar a 4 ° C. Alíquotas e armazenar a penicilina-estreptomicina a -20 ° C.
2. Nuclepore Policarbonato Membrana Track-Etch, 8,0 m, 13 mm (Whatman Nuclepore membrana Track-Etch (Whatman, Florham Park, NJ).
3. Nunclon prato com tampas de poliestireno, 4 poços (Rochester, NY).
4. Pipetas de transferência descartável, estéril (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Figura 1. Dissecção da E12 pulmões embrionárias. (A) E12.5 embrião todo visto do lado direito. (B) membro direito foi removida do embrião. (C) Pinça realizada pela mão esquerda segurando o embrião constante no prato. Setas indicam plano de dissecção (D) pulmão embrionárias está posterior ao coração (removido) E anterior à coluna vertebral. Esta figura mostra os pulmões após a remoção de pele e coração. (E) a remoção Faringe permite a separação do pulmão intacto do embrião. (F) de tecido da faringe e esôfago Extraneous foram cortadas fora. Dissecados pulmão E12.5 embrionárias com traquéia e laringe intacta é mostrado. (Cr) lobo cranial, (Med) lobo Medial, (Ca) lobo caudal, (Acc) lobo acessório, (Le) lobo esquerdo.

Figura 2. FGF9 induz expansão do mesênquima ea dilatação do epitélio no pulmão cultivadas in vitro. (AC) E12.5 pulmão é cultivada por 48 horas na ausência de FGF9. Observe o aumento da ramificação. (DF) pulmão E12.5 crescido por 48 horas em presença de FGF9. Observe a dilatação do epitélio e mesênquima logo após 24 horas de cultura (E). Após 48 horas (F), o efeito sobre o epitélio é ainda mais pronunciada. Barra de escala: AF M 400 ^4.

O protocolo de texto completo para essa abordagem experimental está disponível em Protocolos Springer .