Embrionali di topo Cultura Lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della Branching

Riepilogo

Embrionale precoce cultura organo polmonare è un sistema molto utile per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali. Procede morfogenesi entrambi epiteliali e mesenchimali in condizioni specifiche che possono essere facilmente manipolati in questo sistema.

Abstract

Specifiche del polmone primordiale così come morfogenesi ramificazione, e la formazione di varie linee cellulari polmonare richiede una interazione specifica del polmone endoderma con i suoi mesenchima circostante e mesotelio. Mesenchima del polmone ha dimostrato di essere la fonte di segnali induttivi per la morfogenesi del polmone ramificazione. Epitelio-mesenchimale-mesoteliali interazioni sono anche fondamentali per la morfogenesi del polmone embrionale. Embrionale precoce cultura organo polmonare è un sistema molto utile per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali. Procede morfogenesi entrambi epiteliali e mesenchimali in condizioni specifiche che possono essere facilmente manipolati in questo sistema (in assenza di influenza materna e il flusso di sangue). Ancora più importante questa tecnica può essere facilmente fatto in un serumless, terreni di coltura chimicamente definite. Guadagno e perdita della funzione può essere raggiunto utilizzando proteine ​​espresse, vettori virali ricombinanti e / o analisi dei ceppi di topi transgenici, RNA antisenso, così come knockdown interferenza dell'RNA del gene.

Protocollo

Cultura d'organo è una tecnica molto utile e versatile per lo studio dell'espressione genica e proteica. Questi metodi di coltura ex vivo può essere utilizzato come preliminare o in modo complementare agli studi in vivo.

1. Polmone embrionale di isolamento

1. Cronometrato in gravidanza topi vengono sacrificati il giorno postcoitum 11,5 o 12,5 (E11.5-12.5) narcosi da CO ₂ secondo le linee guida NIH e OLAW. L'animale è posto in una camera e ₂ CO 100% è introdotto. Dopo che l'animale è incosciente il flusso di CO ₂ è aumentata. La morte clinica degli animali deve essere garantita.
2. Tutte le seguenti operazioni devono essere completate in condizioni di sterilità in una cappa a flusso laminare. L'utero viene rimosso dalle femmine gravide. Per rimuovere l'utero dall'animale, le femmine gravide sono posizionati sul dorso e spruzzato con il 70% di etanolo. Un'incisione è fatta nell'addome, e la pelle viene rimossa tirando la pelle verso l'alto tenendo le zampe posteriori dell'animale. La cavità peritoneale è aperta e l'utero viene rimosso dal animale.
3. Il sangue è risciacquate mettendo l'utero in un tubo da 50 ml conica riempita con la soluzione a freddo sale Hanks Bilanciato (HBSS), e il tubo è cullati dolcemente per 2 minuti.
4. L'utero è poi posto in una capsula di Petri sotto il microscopio stereoscopico dissezione, e gli embrioni liberati dall'utero di incidere la parete uterina con le forbici a molla. Gli embrioni vengono raccolte con un mestolo forato, e immessi sul ghiaccio in un nuovo piatto di Petri contenenti HBSS.
5. Sotto il microscopio stereoscopico dissezione, i polmoni embrionali sono sezionati uno ad uno in una capsula di Petri contenente HBSS freddo (Figura 1).
6. Il polmone isolato embrionale è immesso sul ghiaccio in una capsula di Petri contenente HBSS con una pipetta sterile trasferimento.

2. Cultura polmone embrionale

1. 500 microlitri a 1 millilitro di D-MEM/F-12 ben integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina viene aggiunto in un piatto di polistirolo Nunclon.
2. Un Nuclepore policarbonato Track-Etch membrana è posta sulla parte superiore del supporto. Quando il Nuclepore policarbonato Track-Etch membrana è posto sulla parte superiore del supporto, accertarsi che il lato lucido è contro i media, e parte ruvida è rivolto verso l'alto.
3. Un polmone sezionato embrionale è posto sulla parte superiore del policarbonato Nuclepore Track-Etch a membrana con una pipetta sterile trasferimento.
4. La posizione del polmone embrionale viene regolata utilizzando il forcipe. Polmone embrionale immessi sul filtro dovrebbe avere un trachea intatto ed essere posizionati con le loro trachea avere una posizione diritta, consentendo così a tutti i polmoni di avere la stessa pressione interna.
5. Il piatto polistirene Nunclon è trasferita per il tempo desiderato cultura in un incubatore cella (Figura 2).

3. Materiale

1. Embrionale isolamento intero polmone

1. Temporizzata in gravidanza (C57BL6 wild-type o transgenici) topi essere sacrificato il giorno postcoitum 11,5-13,5 (E11.5-13.5).
2. Sale Hanks 'soluzione equilibrata (HBSS) (1X), liquido, senza cloruro di calcio, cloruro di magnesio o solfato di magnesio. (Invitrogen, Carlsbad, CA) integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Conservare il HBSS a temperatura ambiente ed a 4 ° C dopo l'apertura. Aliquota e memorizzare la penicillina-streptomicina a -20 ° C.
3. Stereoscopico microscopio da dissezione (Leica, Wetzlar, Germania).
4. Strumenti di dissezione tra cui Dumont pinze, forbici Belle iris (diritto), Noyes forbici primavera e Moria cucchiaio ® (forato) (Strumenti Scienza Fine, Foster City, CA).

2. Embrionale Cultura intero polmone

1. Dulbecco Modified Media Aquila: Mix nutrienti F-12 (D-MEM/F-12) (1X), liquido, 1:1 Contiene L-glutamina, ma nessun tampone HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA) integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tenere il DMEM/F-12 bottiglia al riparo dalla luce (ad esempio coperto da un foglio di alluminio) e conservare a 4 ° C. Aliquota e memorizzare la penicillina-streptomicina a -20 ° C.
2. Nuclepore policarbonato Track-Etch a membrana, 8.0-m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membrana (Whatman, Florham Park, NJ).
3. Nunclon piatto di polistirolo con coperchio, 4 pozzi (Rochester, NY).
4. Pipette di trasferimento monouso, sterili (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Figura 1. Dissezione di E12 polmoni embrionale. (A) E12.5 embrione tutto visto dal lato destro. (B) zampa anteriore destra è stato rimosso dall'embrione. (C) Pinza teneva per la mano sinistra regge l'embrione costante nel piatto. Le frecce indicano piano di dissezione (D) del polmone embrionale si trova posteriormente al cuore (rimossa) E anteriore alla colonna vertebrale. Questa figura mostra i polmoni dopo la rimozione della pelle e del cuore. (E) la rimozione Faringe consente la separazione del polmone intatto dall'embrione. (F) estranei tessuto della faringe ed esofago sono stati tagliati via. Sezionato E12.5 polmone embrionale con la trachea e della laringe intatta viene mostrato. (Cr) lobo craniale, (Med) lobo mediale, (Ca) lobo caudale, (Acc) lobo accessorio, (Le) lobo sinistro.

Figura 2. FGF9 induce espansione del mesenchima e la dilatazione dei polmoni in epitelio coltivate in vitro. (AC) E12.5 polmonare è cresciuto per 48 ore in assenza di FGF9. Si noti l'aumento della ramificazione. (DF) E12.5 polmone cresciuto per 48 ore in presenza di FGF9. Si noti la dilatazione dei epitelio e mesenchima già dopo 24 ore di cultura (E). Dopo 48 ore (F), l'effetto sul epitelio è ancora più pronunciato. Scala grafica: AF 400 micron ^4.

Il protocollo testo completo di questo approccio sperimentale è disponibile in protocolli di Springer .