Мышиных эмбриональных легких культуры, системы оценки Молекулярные механизмы Ветвление

Резюме

Раннее эмбриональное органной культуры легких очень полезная система для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий. Оба эпителиальных и мезенхимальных морфогенез протекает в специфических условиях, которые можно легко манипулировать в этой системе.

Аннотация

Легкого изначальный спецификации, а также ветвление морфогенеза и формирования различных легочных клеточных поколений требует специфического взаимодействия легких энтодермы с окружающей его мезенхимы и мезотелия. Легкого мезенхимы было показано, быть источником индуктивных сигналов для легких ветвления морфогенеза. Эпителиальные-мезенхимальных-мезотелиальной взаимодействия также имеет важное значение для эмбрионального морфогенеза легких. Раннее эмбриональное органной культуры легких очень полезная система для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий. Оба эпителиальных и мезенхимальных морфогенез протекает в специфических условиях, которые можно легко манипулировать в этой системе (при отсутствии материнского влияния и кровотока). Что еще более важно этот метод может быть легко сделано в serumless определенным химическим медиа культуры. Усиление и потери функции можно достичь с помощью выразил белков, рекомбинантных вирусных векторов и / или анализа трансгенных линий мышей, антисмысловые РНК, а также РНК-интерференции генов нокдаун.

протокол

Органная культура очень полезный и универсальный метод для изучения генов и экспрессии белка. Эти бывшие культуры методами естественных условиях можно использовать в качестве предварительного или в дополнение к в естественных исследованиях.

1. Эмбриональные изоляции легких

1. Временный беременных мышей приносятся в жертву на postcoitum день 11,5 или 12,5 (E11.5-12.5) СО ₂ наркоза в соответствии с НИЗ и OLAW руководящих принципов. Животное помещают в камеру и 100% СО ₂ введен. После животное находится в бессознательном состоянии CO ₂ потока увеличивается. Клиническая смерть животного должна быть обеспечена.
2. Все следующие шаги должны быть завершены в стерильных условиях в ламинарном боксе. Матка удаляется из беременных женщин. Для удаления матки из животных, беременных самок расположены на спине и опрыскивают 70% этанола. Надрез в брюшной полости и кожи удаляется, потянув кожу вверх, держа задние ноги животного. Брюшную полость открывается и матка удаляется от животного.
3. Кровь смывается, помещая матки в 50 мл коническую трубку, наполненную холодной Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), и трубка мягко качались в течение 2 минут.
4. Матку помещают в чашку Петри под стереоскопическим микроскопом рассечение, и эмбрионы освобожден из матки надрезание стенки матки с помощью пружинных ножниц. Эмбрионы убирают с использованием перфорированной ложкой, и помещают на лед в новой чашки Петри содержащие HBSS.
5. Под стереоскопический микроскоп рассекает, эмбриональные легкие расчлененный по одному в чашки Петри, содержащие холодной HBSS (рис. 1).
6. Изолированных эмбриональных легких находится на льду в чашке Петри содержащие HBSS помощью стерильной пипетки передачи.

2. Эмбриональные культуры легких

1. 500 мкл на 1 мл на лунку D-MEM/F-12 дополнена с 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина добавляют в блюда из полистирола Nunclon.
2. Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана помещается в верхней части средств массовой информации. Когда Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана помещается в верхней части средств массовой информации, чтобы убедиться, что блестящая сторона выступает против средств массовой информации, и грубой стороной вверх.
3. Расчлененный эмбриональных легких находится на вершине Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембранные использованием стерильной пипетки передачи.
4. Эмбриональной позиции легкого регулируется с помощью щипцов. Эмбриональные легких размещены на фильтр должен иметь нетронутой трахеи и быть размещены с их трахеи, имеющие прямое положение, что позволяет все легкие иметь те же внутреннее давление.
5. Блюдо Nunclon Полистирол переносится на желаемый культуры времени в клетке инкубатора (рис. 2).

3. Материалы

1. Эмбриональные Всего изоляции легких

1. Временный беременных (C57BL6 дикого типа или трансгенных) мышей быть принесен в жертву на postcoitum день 11,5 до 13,5 (E11.5-13.5).
2. Сбалансированный Соль Хэнкса Решение (HBSS) (1X), жидкие, без хлорида кальция, хлорид магния или сульфата магния. (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Магазин HBSS при комнатной температуре и при температуре 4 ° С после открытия. Алиготе и хранить пенициллин-стрептомицина при температуре -20 ° C.
3. Стереоскопический микроскоп рассекает (Leica, Wetzlar, Германия).
4. Препарирование инструментов, включая Дюмон щипцы, ножницы изобразительных радужной оболочки глаза (прямо), Нойес весной ножницы и Мории ® ложке (перфорированные) (изобразительных инструментов науки, Foster City, CA).

2. Эмбриональные Всего культуры легких

1. Дульбеко изменения Eagle среда: Питательная Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1X), жидкие, 1:1 Содержит L-глютамина, но не HEPES буфера. (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Держите бутылку DMEM/F-12 от света (например, покрыты алюминиевой фольгой) и хранить при 4 ° C. Алиготе и хранить пенициллин-стрептомицина при температуре -20 ° C.
2. Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана, 8.0-м, 13 мм (Ватман Nuclepore Трек-Etch мембраны (ватман, Florham Парк, штат Нью-Джерси).
3. Nunclon Полистирол блюда с крышками, 4 скважины (Рочестер, штат Нью-Йорк).
4. Одноразовые пипетки передачи, стерильные (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания).

Рисунок 1. Препарирование E12 эмбриональных легких. (А) E12.5 весь эмбрион смотреть с правой стороны. (B) правой передней лапе был удален из эмбриона. (С) Пинцет проводимых левой рукой держа эмбриона устойчивы в блюдо. Стрелки указывают план расчленения (D) эмбриональных легких лежит кзади от сердца (удален) И впереди позвоночника. Эта цифра показывает, легких после кожи и сердца удаления. (Е) глотки удаления допускает разделение нетронутыми из легких эмбриона. (F) Посторонние глотки и пищевода ткани были отделаны прочь. Расчлененный E12.5 эмбриональных легких с неповрежденными трахеи и гортани показано на рисунке. (Cr) Черепные доли, (Med) медиальной доли, (Ca) Хвостовой доли, (ACC) Аксессуары доли, (Le) Левая доля.

Рисунок 2. FGF9 вызывает расширение мезенхимы и расширение эпителий легких, выращенных в лабораторных условиях. (AC) E12.5 легких выращивают в течение 48 часов при отсутствии FGF9. Обратите внимание на увеличение ветвления. (DF) E12.5 легких выросла на 48 часов в присутствии FGF9. Обратите внимание на расширение эпителия и мезенхимы уже после 24 часов культуры (E). Через 48 часов (F), воздействие на эпителий становится еще более заметным. Шкала бар: AF 400 мкм ^4.

Полный текст протокола для этого экспериментальный подход доступен в протоколах Springer .