Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Resumo

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Resumo

Injeção intracraniana de vetores virais projetadas para expressar uma proteína fluorescente é uma técnica de rotulagem versátil para visualização de subgrupos específicos de células em diferentes regiões do cérebro in vivo e em secções do cérebro. Ao contrário da injeção de corantes fluorescentes, rotulagem viral oferece segmentação de tipos de células individuais e é menos caro e demorado do que estabelecer linhas de ratinhos transgénicos. Nesta técnica, um vetor adeno-associado (AAV) viral é injetado intracraniana usando coordenadas estereotáxica, uma micropipeta e uma bomba automatizada para entrega preciso de AAV para a área desejada com o mínimo dano ao tecido circundante. Parâmetros de injeção pode ser adaptado para experimentos individuais, ajustando a idade do animal em injeção, injeção de localização, volume de injeção, a taxa de injeção, sorotipo AAV eo promotor dirigindo a expressão do gene. Dependendo das condições de escolhido, virally induzida a expressão do transgene pode permitir a visualização de grupos de células, as células individuais ou multa processos celulares, até o nível das espinhas dendríticas. O experimento mostrado aqui representa uma injeção de double-stranded AAV expressando a proteína fluorescente verde para a rotulagem de neurônios e células gliais no córtex visual primário do mouse.

Protocolo

1. Manuseio e Armazenamento de vírus

1. Uma protecção adequada e técnicas de manejo devem ser escolhidos com base no nível de biossegurança do vírus para ser usado. Estas práticas podem ser encontrados em Biossegurança em Microbiologia e Biomédica ^ª edição Laboratories 5, disponível no site do CDC
   ( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). O uso de vetores AAV é aprovado para o Nível de Biossegurança 1 (NB-1). Para o experimento mostrado aqui, um jaleco e luvas vai ser usado durante o manuseamento do vírus, de acordo com os procedimentos para a manipulação de NBS-1 agentes.
2. Para preservar a atividade do vírus é melhor dividi-lo em pequenas alíquotas para evitar o congelamento e descongelamento repetidos.
3. Prepare um Gabinete de Biossegurança (BSC) Classe II de alíquotas de vírus por limpar o BSC de quaisquer objetos desnecessários e esterilizar a superfície com EtOH 70%. Coloque um copo contendo solução de água sanitária a 10% no capô para a recolha de resíduos contaminados AAV. Também colocado no BSC são estéreis tubos de 0,5 ml e um recipiente de gelo seco.
4. Descongelar estoque viral no gelo fora do BSC.
5. Vortex vírus e abrir o tubo dentro do BSC.
6. Pipetar volume da alíquota desejada (por exemplo, 5 mL) em um tubo de 0,5 ml, fechar o tubo e colocá-lo no gelo seco para flash-freeze o vírus.
7. Quando todos os vírus foi aliquotado, alienar o tubo de vírus e ponteiras no contentor de resíduos contendo lixívia a 10%.
8. Remova o recipiente de resíduos da capa e adicionar água sanitária a 10% adicionais, em seguida, despeje a lixívia na pia. Descarte de resíduos plásticos em um recipiente biohazard conforme instruído pelo oficial de seu instituto de biossegurança.
9. Limpar qualquer equipamento ou superfícies que entraram em contato com o vírus com água sanitária a 10%. Descarte as luvas.
10. Alíquotas armazenar em freezer -80 C °.

2. Cirurgia

1. Cobrir a área cirúrgica com papel absorvente laboratório banco. Instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados e cirurgia feita sob condições assépticas, de acordo com a biossegurança de sua instituição e as diretrizes de uso animal.
2. Escolha uma área adjacente à área cirúrgica, que será dedicado a carregar o micropipetas com o vírus, e cobri-lo com papel absorvente laboratório banco. Transferir uma parte alíquota do vírus em um recipiente de gelo nesta área e permitir que o vírus para descongelar em gelo como a cirurgia está sendo realizada.
3. Configuração de um recipiente de resíduos de lixívia a 10% na área dedicada vírus manuseio para a eliminação de pontas de pipeta, etc, que entram em contato com o vírus.
4. Puxe uma micropipeta de vidro Wiretrol a um diâmetro da ponta de aproximadamente 20 microns. Coloque uma pequena gota de óleo mineral na extremidade sem corte da micropipeta e inserir o êmbolo de arame fornecido com o micropipetas.
5. Assegurar a micropipeta no grampo do braço micropump.
6. Injetar um rato por via subcutânea com buprenorfina na dose de 0,5 mg / kg. Anestesiar o rato com Avertin via intraperitoneal com uma dose de 200 mg / kg e remover o cabelo do topo da cabeça com uma tesoura cirúrgica, certificando-se de deixar margens grande o suficiente para impedir que o cabelo de entrar na incisão.
7. Anexar uma manta de aquecimento à base de um stereotax para manter uma temperatura corporal de 37 ° C durante toda a cirurgia e segura o mouse na stereotax.
8. Banhar a cabeça com três esfrega alternadas de etanol e betadine para esterilizar a área.
9. Coloque uma gota de TOBRADEX pomada em cada olho para manter os olhos úmidos durante a cirurgia.
10. Faça uma incisão abaixo da linha média da cabeça e puxe a pele de volta para expor o crânio.
11. Remova cuidadosamente a fáscia do crânio usando uma pinça de ponta fina.
12. Localizar a área a ser injetado usando coordenadas estereotáxica e marcar o crânio com uma caneta cirúrgica.
13. Usando uma broca de dentista com um 1,4 milímetros rebarba, uma área fina do crânio de aproximadamente dois milímetros de diâmetro, até as rachaduras do crânio, dividindo a área diluído em vários segmentos.
14. Todo esse procedimento, manter o crânio úmido com aplicações de soro fisiológico estéril.
15. Realizar uma craniotomia delicadamente removendo os segmentos crânio diluído com extra-fina com ponta fórceps.

3. Preparação de injeção

1. Com um KimWipe colocado sobre a tampa, abra o tubo de vírus e de pipeta 1.5uL (para uma injeção 1uL) do vírus em um pequeno pedaço de parafilme.
2. Coloque a ponta da micropipeta para o estoque viral e retirar manualmente o êmbolo. Se a dificuldade é experimentada desenho estoque viral para a micropipeta, a ponta pode ser ligeiramente aumentada ser uma perfuração KimWipe com a micropipeta para quebrar uma pequena parte do vidro.
3. Braço inferior micropump em êmbolo até uma pequena quantidade de vírus é dissipada a partir da ponta da micropipeta. Remover esta pequena gota com um cotonete e aplicador de descarte em erascontainer e.
4. Aplique uma gota de óleo mineral para a ponta da micropipeta para evitar o entupimento como a micropipeta é abaixado no cérebro.

4. Injeção de vírus

1. Usando o X e Y estereotáxica coordenadas, a posição da micropipeta sobre a área a ser injetada. Neste experimento, os estereotáxica coordenadas utilizadas para localizar córtex visual primário é posterior ao bregma 2,7 milímetro e 2,5 mm lateral à linha média. Muito lentamente o micropipeta (a uma taxa aproximada de 1mm/1minute) para a posição Z adequada.
2. Digite os parâmetros de injeção desejada na caixa de controlador de SYS MICRO4 micropump e iniciar a injeção. Para esta experiência, 1 microlitro mais de 10 minutos será usado como uma taxa de injeção.
3. Quando a injeção é terminar, deixe a pipeta para descansar por 1-2 minutos para evitar o efluxo do vírus durante a remoção. Após este período, muito lentamente remover a micropipeta do cérebro (mesma taxa acima).
4. Sutura no couro cabeludo e selá-lo com cola de tecido. Injetar o animal por via subcutânea com buprenorfina na dose de 0,1 mg / kg a cada 8-12 horas nas próximas 72 horas, ou enquanto o animal está exibindo sinais de dor. Permitir que o animal se recuperar sob uma lâmpada de calor até que esteja deambulando e pronto para ser devolvido à sua gaiola. Experimentos com imagens pode ser iniciada após o tempo de incubação desejado (dias a semanas após a injeção viral).

5. Limpeza

1. Lavar a micropipeta com lixívia a 10% e descartá-lo em um recipiente adequado.
2. Dispor de recipiente de resíduos da mesma maneira como Seção 1.
3. Descarte o papel bancada do laboratório em bin de risco biológico e limpar todas as superfícies e instrumentos que possam ter estado em contacto com o vírus com água sanitária a 10%.
4. Vírus não utilizados podem ser congelados novamente, tendo em mente que repetidos de congelamento / descongelamento causar degradação do vírus.

6. Resultados representante

Figura 1. Transduzidas neurônio após a injeção de double-stranded adeno-associated virus sorotipo 1 (dsAAV S1) carregando proteína verde fluorescente (GFP) sob controle do promotor CMV. O corpo da célula, bem como dendritos proximais e distais são claramente visíveis nas seções fixas fotografada usando um microscópio de epifluorescência. Barra de escala = 100 mm.

Figura 2. Labeling típico de uma injeção do vírus intracraniana em córtex visual primário usando S1 dsAAV mostrando a extensão da disseminação viral, assim como neurônios rotuladas, glia e processos. Barra de escala = 250 mM.

Figura 3. Rotulagem de células no hipocampo usando S1 dsAAV. Barra de escala = 250 mM. Estes números são adaptados de Lowery et al. 2009 ¹

Discussão

Virally mediada entrega do gene tem um grande potencial para o estudo de processos neurológicos e tratamento de distúrbios cerebrais ^1,2,3. A grande versatilidade desta técnica também pode ser explorada para fluorescente rótulo células para geração de imagens tanto in vitro como in vivo ^4. Aqui demonstramos um procedimento detalhado para a transdução de neurônios e células gliais no córtex visual do rato usando um double-stranded do vírus adeno-associação expressan...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625	Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Fine Science Tools	14084-08
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Fine Science Tools	11152-10
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled	Fine Science Tools	11251-35	Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Fine Science Tools	11000-12
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece	Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter	Fine Science Tools	19008-14
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul	VWR international	5-000-1001 or 53480-287
Mineral oil	VWR international	29447-338
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)	World Precision Instruments, Inc.	M3301-M3-R	Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
Sutures	VWR international	95056-952
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Tobradex			Available from your institution’s veterinary services