High-Throughput medição e classificação de P orgânico em amostras ambientais

Resumo

Este protocolo descreve um método de alto rendimento da hidrólise enzimática que utiliza um leitor de microplacas para medir e classificar o fósforo do solo como P monoésteres, diésteres de P inorgânico e P. Até 96 amostras podem ser medidos de uma só vez em um laboratório padrão.

Resumo

Muitos tipos de compostos orgânicos de fósforo (P) moléculas existem em amostras ambientais ^1. P medições tradicionais não detectam estes compostos orgânicos P, uma vez que não reagem com reagentes colorimétricos ^2,3. Hidrólise enzimática (EH) é um método emergente para caracterizar com precisão formas de P orgânico em amostras ambientais ^4,5. Este método só é superado em precisão por Espectroscopia de fósforo-31 de Ressonância Magnética Nuclear ⁽³¹ P-NMR), um método que é caro e requer especializados training6 técnica. Nós adaptamos um método de hidrólise enzimática capaz de medir a três classes de fósforo (P monoéster, P diéster e P inorgânico) para um sistema de leitor de microplacas ^7. Este método fornece aos pesquisadores um meio rápido, preciso, acessível e de fácil utilização para medir espécies P nos solos, sedimentos, adubos e, se concentrou, amostras aquáticas. Este é o único método de alto rendimento para medir as formas e enzima labilidade de P orgânico que pode ser realizado em um laboratório padrão. Os dados resultantes fornece insights para os cientistas que estudam o conteúdo do sistema de nutrientes e potencial de eutrofização.

Protocolo

1. Extração de fósforo

1. Prepare uma solução de 1L de 0,25 M de hidróxido de sódio (NaOH, 40,00 g / mol) + 0,05 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 292,24 g / mol).
2. Adicionar 30 mL da solução de NaOH + EDTA a 2 g de solo úmido ou seco / amostra em um tubo cônico de 50 mL.
3. Incube com agitação por 16 h à temperatura ambiente.
4. Centrifugar a 3000 xg por 3 minutos.

2. Ajuste de pH da amostra Extract

1. Transferência de uma alíquota de 0,1 mL para um tubo de 1,5 mL micro centrífuga.
2. Adicionar 0,017 mL de ácido acético 2,5 M, 0,144 mL de 0,4 M tampão acetato (70,5% de acetato de sódio [CH ₃ COONa, 82,03 g / mol] e 29,5% de ácido acético, pH 5,0) e 0,739 mL de água deionizada.
3. O volume final do extrato ajustado será de 1 mL eo pH final será 5,0.

3. Enzima Preparação Solução stock

1. Prepare 1 L de 0,1 M de acetato de sódio (CH ₃ COONa, 82,03 g / mol) solução, pH 5.0.
2. Prepare 2 x 10 mL de ácido soluções estoque fosfatase no buffer de acetato de sódio preparada na etapa 3,1 tal que as concentrações finais são cada 0,5 Unidades / mL.
   Fosfatase ácida Tipo I de Triticum aestivum (gérmen de trigo; GP, geralmente 0,5 mg sólida U-1, EC 3.1.3.2)
   Fosfatase ácida Tipo IV-S de Solanum tuberosum (batata; PP, geralmente 4,6 mg U-1 sólido, EC 3.1.3.2)
   * Unidades de actividade são especificados pelo fornecedor, onde uma unidade é definida como a libertação de um micromole de ortofosfato para a solução por hora a 37 ° C.
3. Reconstituir liofilizado nuclease P1 (CE 3.1.30.1) de Penicillium citrinum (fungos; NP1, geralmente 500 U mg ^-1 sólido) em um mL de água deionizada, isso agora pode ser armazenado a 4 ° C para uso futuro.
4. Pipeta NP1 em um dos 10 tubos mL preparada no passo 3,2 tais que a concentração final é de 2,5 Unidades / mL NP1; misture suavemente por inversão várias vezes.
5. Centrifugar as duas soluções enzimáticas 10 mL 3000 xg por 30 minutos.

4. P curva de calibração e controles

1. Prepare 1 L de 1 mM fosfato de potássio (K2HPO4, 174,18 g / mol) solução estoque.
2. Adicionar 1 mL da solução estoque 1 mM fosfato de potássio a um tubo de centrífuga de 1,5 mL e 0,5 mL realizar sete diluições em série.
3. Descartar o primeiro tubo para que você tenha sete diluições variando de 20 nmol-0.625 nmol P.
4. Transferência de 80 mL de cada tubo em duplicado para linhas B - H de um padrão em placas de 96 poços.
5. Adicionar 80 mL de tampão acetato de sódio (ponto 3.1) com a linha A de colunas 11 e 12 este é o ponto de calibração 0 nmol P.
6. Cada coluna 11 e 12 agora contém oito amostras de referência de 0 a 20 nmol de fosfato inorgânico nmol.
7. Coluna 10 conterá os seguintes controles:
   1. Adicionar 40μL PP + solução enzimática GP + 40 mL de tampão de acetato de sódio (ponto 3.1) para os três primeiros poços na coluna 10.
   2. Adicionar 40 mL PP + GP + solução enzimática NP1 + 40 mL de tampão de acetato de sódio para os próximos três poços.
   3. Adicionar 40 mL de acetato de sódio contendo 10 glicose-6-fosfato nmol (C ₆ H ₁₁ O ₉ Na ₂ P ₂ O • xH, 304,1 g / mol) + 40 mL PP + solução enzimática para um GP bem e para o bem-finais em solução Coluna 10 acetato de sódio em vez de adicionar solução enzimática.

5. Amostra Enzima + Incubação

1. Cada amostra que está sendo testado vai ocupar os primeiros 9 poços em uma linha de uma placa padrão de 96 poços.
2. Distribuir 40 mL de extratos com pH ajustado amostra da Seção 2 para poços 09/01 em até 8 linhas.
3. Depois de todas as amostras foram distribuídas * use uma pipeta multicanal para distribuir PP + solução enzimática GP às colunas 1-3, PP + GP + NP1 às colunas 4-6 e tampão acetato de sódio (preparado na seção 3.1) para colunas 7-9.
   * Esta etapa deve ser realizada rapidamente para assegurar todas as amostras de obter tempo de incubação equivalente.
4. Cobrir a placa de 96 poços com uma tampa e incubar amostras + soluções enzimáticas, controles e curva de calibração exatamente 1 hr a 37 ° C.

6. Medida colorimétrica de Lançamentos e P inorgânicos Background

1. Prepare 50 mL de cada uma das seguintes soluções em água deionizada:
   Solução A *: 0,1 M de ácido ascórbico (C6H8O6, 176,12 g / mol) + ácido tricloroacético 0,5 M (Cl3CCOOH, 163,39 g / mol)
   Solução B: 0,01 M molibdato de amônio ((NH4) 2MoO4, 196,01 g / mol)
   Solução C: 0,1 M citrato de sódio (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 g / mol) + 0,2 arseniato de sódio M (NaAsO2, 129,91 g / mol) + 5% de ácido acético glacial
   (CH3CO2H, 60,05 g / mol) * A solução deve ser preparado diariamente.
2. Adicionar 25 ml de solução SDS, 100 ml de solução A, 20 mL de solução B e 50 mL de C e solução para todos os poços na pl de 96 poçoscomeu. Fazer isso rapidamente com uma pipeta multicanal.
3. Cobrir a placa e incubar 30 minutos à temperatura ambiente.
4. Medir a absorvância a 850 nm em qualquer leitor de micro-placa ajustável.

7. Classificação de Compostos P

1. Importação de dados brutos em um aplicativo de planilha (por exemplo, Microsoft Excel).
2. Traçar a curva de calibração de fósforo inorgânico: 0-40 nmol P sobre o eixo-x ea média de medições de absorbância duplicada no eixo-y.
3. Executar uma regressão linear e encontrar a equação da linha de melhor ajuste.
4. Colunas 1-3: Diretamente aplicar a curva de calibração, isto é fundo P. inorgânicos
5. Colunas 4-6: Média de valores da amostra triplicado e subtrair controles (solução enzimática + P inorgânico de fundo) do bruto absorbância-P este é derivado de mono-ésteres hidrolisáveis ​​P.
6. Colunas 7-9: O mesmo que 7,5, exceto os valores de absorbância subtrair colunas 4-6 - este é P de diésteres hidrolisável P.
7. Converter os dados de absorvância em nmol P liberado pela aplicação da equação de calibração.
8. nmol P liberado pode ser relacionado para mg P / kg de solo original. Alternativamente, avaliando as proporções de cada classe P também pode ser uma abordagem útil para a análise de dados.

8. Resultados representativos:

Uma rápida inspeção visual da placa de 96 poços após a química colorimétrico vai oferecer pistas sobre se ou não o procedimento foi realizado corretamente. A primeira coisa a verificar é o nível de líquido em cada poço, verificando o perfil lado do prato. Deve haver exatamente 275 mL de reagentes em todos os poços. Em seguida, inspecionar visualmente a cor dos poços de amostras duplicadas triplicado e poços de calibração. Estas técnicas devem ser replicar o mesmo tom de azul. Em seguida aplicar a curva de calibração para os dois poços contendo glicose-6-fosfato e verificar que eles lançaram todos os nmol 10 de P. Após inorgânicos P total extraído foi medido utilizando ICP-OES ou um método alternativo, verifique se o P total valores calculados utilizando este protocolo não excedam a quantidade de P que foi extraído.
Nota: o gerenciamento de dados cuidadosa na planilha vai ajudar a proteger contra erros quantitativos. Você estará lidando com um monte de números de uma vez, criando assim um modelo será tempo bem gasto.

Figura 1. A placa de 96 poços mostrando resultados para 8 amostras (linhas AH) e uma curva de calibração (colunas 11 e 12). Controles estão na coluna 10. Aumentar a intensidade de cor entre as colunas 1-3 e 4-6 é devido ao hidrolisado compostos monoester P, entre as colunas 4-6 e 7-9 é devido a compostos de P diéster hidrolisada.

Figura 2. Distribuição das classes P em NaOH 0,05 M-0,25 M EDTA extrato de uma amostra de solo Vermont usando alto rendimento de hidrólise enzimática. Barras de erro indicam o desvio padrão, n = 3.

Discussão

Por sua própria natureza, um método rápido utilizando pequenos volumes requer muito cuidado. Portanto, os passos mais críticos são aqueles que envolvem soluções de pipetagem para a placa. Precisas e, mais importante, a técnica da pipeta consistentes são essenciais para o sucesso deste ensaio.

A extração NaOH-EDTA permitirá que a maior parte do P em amostras de muitos para ser caracterizada em três classes: ortofosfato, P monoéster e solos diéster P., adubos, sedimentos ou qualquer outra amostra do ambiente que contém NaOH-EDTA-extraível P pode ser caracterizada . Formas de P em amostras ambientais não são necessariamente estáveis ​​e esta técnica vai garantir amostras são caracterizadas antes de amostras são comprometidos sem a necessidade de empregar um exército de pesquisadores.

Este ensaio é especialmente adequado quando um grande número de amostras a serem processadas. As necessidades de reagentes e requisitos de espaço foram reduzidas a um nível administrável (por exemplo, tubos de 1,5 mL de microcentrífuga em vez de 50 frascos de vidro mL). Esta adaptação também limita a produção de resíduos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Ácido acético glacial	Sigma-Aldrich	242853
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S2889
Trigo fosfatase ácida	Sigma-Aldrich	P3627
Fosfatase ácida de batata	Sigma-Aldrich	P1146
Nuclease P1	Sigma-Aldrich	N8630
Fosfato de potássio	Sigma-Aldrich	P2222
	Sigma-Aldrich
	Sigma-Aldrich
Glicose-6-fosfato	Sigma-Aldrich	G7250
SDS	Sigma-Aldrich	L4390
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A5960
TCA	Sigma-Aldrich	T9159
Molibdato de amônio	Sigma-Aldrich	A1343
Citrato de sódio	Sigma-Aldrich	S1804
Arseniato de sódio	Sigma-Aldrich	S9663