Um protocolo Optimizado para Criação Fopius arisanus, Um parasitóide de Frutas Tephritid Flies

Resumo

Fopius arisanus é um parasitóide de ovos-larvas de moscas da fruta Tephritid que é utilizado com sucesso no controle biológico dessas pragas importantes tropical. Descrevemos aqui um protocolo otimizado para a criação de F. arisanus em pequena escala, utilizando materiais facilmente disponíveis.

Resumo

Fopius arisanus (Sonan) é um parasitóide de moscas da fruta importante Tephritid por pelo menos duas razões. Primeiro, é o um dos únicos três parasitóides opiine conhecido para infectar o hospedeiro durante a fase de ovo ^1. Em segundo lugar, tem uma ampla gama de hospedeiros em potencial de frutas voar. Talvez devido à sua história de vida, F. arisanus tem sido um sucesso usado para controle biológico de moscas da fruta em várias regiões tropicais ^2-4. Um impedimento para o amplo uso do F. arisanus para controle de mosca da fruta é que é difícil estabelecer uma colônia de laboratório estável ^5-9. Apesar desta dificuldade, na década de 1990 pesquisadores do USDA desenvolveu um método confiável para manter populações de laboratório de F. arisanus ^10-12. Há um interesse significativo em F. arisanus ^13,14 biologia, especialmente quanto à sua capacidade de colonizar uma grande variedade de hosts Tephritid ^14-17; interesse é especialmente dirigido pelo alarmante disseminação de pragas mosca Bactrocera frutas para novos continentes na última década ^18. Pesquisa mais aprofundada sobre F. arisanus e implementações adicionais desta espécie como um agente de controle biológico irá beneficiar de otimizações e melhorias de métodos de criação. Neste protocolo e artigo vídeo associado descrevemos um método otimizado para a criação de F. arisanus com base em uma abordagem descrita anteriormente ^12. O método descrito aqui permite criação de F. arisanus em pequena escala, sem a utilização de frutas, utilizando materiais disponíveis em regiões tropicais em todo o mundo e com as exigências de trabalho relativamente baixa manual.

Protocolo

1. Prepare ovos do hospedeiro para o parasitismo mosca da fruta

1. Prepare um substrato para os ovos de mosca de fruta a ser parasitados por preparar agar (alternativamente, Gelcarin GP812, FMC Biopolymer, Ewing NJ; uma opção mais rentável) pratos cheios, 10 cm de comprimento de cada lado e 1,5 cm de profundidade. Prepare ágar na concentração de 9 g por litro de água.
2. Preencha pratos até a borda com ágar líquido (cerca de 70ml) e deixe esfriar e solidificar (pelo menos 45 minutos).
3. Uma vez que os blocos de agar são sólidos, aplique uma camada de papel de seda (uma única camada de tecido 'Preferências' Georgia Pacific lote), cobrindo a parte superior de cada bloco. O tecido deve ficar facilmente para o agar por causa da umidade da superfície.
4. Aplicar um volume de 0,5 ml de ovos de mosca de fruta em suspensão na água para a superfície coberta de tecido dos blocos de ágar. No nosso insetário, isso é equivalente a cerca de 6000 ovos de Bactrocera dorsalis (12000 ovos por ml).
5. Use um pano limpo 2,5 centímetros de largura pincel umedecido em água para espalhar os ovos mosca da fruta uniformemente sobre a superfície do tecido.
6. Coloque os ovos de mosca de fruta sob a tela de fundo do parasitóide gaiolas para permitir a oviposição. Toque a parte inferior da tela de fundo para remover parasitas mortos que podem obstruir os ovos. É melhor se a tela de baixo não toca os ovos.
7. Permitir que os parasitas para oviposit durante a noite e no dia seguinte, cerca de 21 horas. Isso é tempo suficiente para que uma alta porcentagem dos ovos a serem parasitados. Exposição mais longa superparasitization riscos.

2. Incubação e de pupação fruto hospedeiro parasitado moscas

1. Prepare criação recipiente, colocando 3-3,5 blocos de ágar preparado de ovos parasitados por 1,25 litros de dieta de frutas fly ¹⁹ com ovos voltada para cima.
2. Coloque o recipiente dieta com ovos em um riser sobre uma camada de 1,5 cm de profundidade grau de vermiculita fina ou areia lavada em um recipiente maior pupação. Cubra o recipiente pupação com uma tampa e fita adesiva nas bordas da fita adesiva com. Vermiculita pode ser reutilizado após peneiração (veja abaixo).
3. Verifique se há espaço suficiente entre a parte superior do recipiente dieta e a tampa do frasco pupação de larvas de mosca se arrastar para fora e 'pop' ²⁰ no vemiculite abaixo.
4. Mover recipientes pupação para uma sala a 27 ° C e 80% de umidade relativa (UR) por uma semana. Recipientes cubra com um pano escuro para os primeiros quatro dias depois remover o tecido para os dias restantes.
5. Remover dieta larval após uma semana, uma vez que as larvas estalaram e entrou na vermiculita para pupação. Se houver larvas nos vermiculite, permitir-lhes pupate durante a noite.
6. Peneira as pupas da vermiculita. Comece com uma peneira grossa (cerca de 3 mm), em seguida, use uma peneira para remover qualquer lado restantes aglomerados de vermiculita.

3. Classificação e seleção

1. Pupa contendo F. arisanus pode ser parcialmente segregado de moscas de frutas unparasitized por tamanho. Coletar pupa entre 1,65 e 2,26 milímetros de diâmetro, como estes irão ser enriquecido para moscas parasitadas. ¹² pupários que são menores contêm principalmente parasitóides subdimensionado, pupa maiores contêm principalmente moscas. Note também que para as pupas parasitadas a porcentagem de fêmeas se correlaciona positivamente com o tamanho ^12.
2. Uma variedade de métodos podem ser empregados para classificar pupas por tamanho. Vamos descrever um método mecânico usando um tamanho personalizado classificador ^21.
3. Pupas lugar no funil no topo de um alimentador de vibração que lentamente alimenta o classificador de tamanho.
4. Alimentar o pupas no classificador de tamanho, que consiste de um par de barras de rolamento ligeiramente divergentes em um ângulo de 30 °. A queda de pupas individualmente por tamanho em uma matriz de slots que vazio em dez recipientes separados através de um funil.
5. Recolher os copos de pupas na faixa de tamanho de 1,65-2,26 mm e colocá-los em uma gaiola de emergência por mais 7 dias até que a maioria moscas emergiram as pupas unparasitized.
6. Em seguida, use um ventilador para separar pupários vazios daqueles insetos contendo ainda.

4. F. arisanus surgimento e manutenção

1. Para manter a colônia de F. arisanus usar uma gaiola parasitóide segurando com uma frente de vidro removível, cerca de 25 cm de comprimento de cada lado. A gaiola tem um milímetro de triagem ^dois na parte superior e dois dos lados. A parte de trás da gaiola é coberto por um lençol de borracha com um furo de 9 cm para o acesso. O fundo da gaiola tem um recorte cobertas por dentro com 1-2mm de tela ² grandes o suficiente para permitir a colocação de dois blocos de agar com ovos de mosca de fruta para oviposição do parasitóide.
2. As gaiolas holding também deve ter uma porção coloridas ao longo do trimestre inferior da fachada de vidro para minimizar a luz que pode criar crowding parasitóide ao longo da frente da gaiola, resultando em mortalidade elevada.
3. Coloque cerca de 11 g desses seleçãoted pupas em recipientes plásticos de aproximadamente 9 cm de diâmetro. Isso deve produzir cerca de 600-700 parasitas por gaiola. Seleção de tamanho deve resultar em cerca de 60% do sexo feminino.
4. Anexar tampas selecionados para os recipientes. As tampas devem ser cobertos com 2 mm ² de triagem, o que permitirá adultos F. arsianus para deixar os recipientes após a emergência, mas, conterá qualquer moscas de frutas restantes.
5. Manter os parasitas a 24 ° C e cerca de 45% RH com uma ventilação 12:12 fotoperíodo e bom. Se a mortalidade alta é observada, movendo-se as gaiolas ao ar livre por algumas horas por dia ou ventilação pode aumentar a reduzi-lo. Parasitas deve estar pronto para oviposit em uma semana adicional e devem ser produtivo por mais duas semanas.
6. Streak não diluído mel girado ao longo do topo das gaiolas, pelo menos, três vezes por semana ou sempre que o mel disponível é seco. Aplique o mel girou em estrias estreitas usando um dedo. Note que, se as estrias são muito pesados ​​o mel vai gotejar para dentro da gaiola, se muito leve o mel vai secar rapidamente e exigem reaplicação freqüente.
7. Colocar os blocos de ágar (10 cm x 10 cm x 4 cm) nos topos das gaiolas para fornecer umidade para os parasitas. Estes devem ser mudadas duas vezes por semana.

5. Resultados representativos:

Relatamos aqui os resultados de procedimentos de controle de qualidade realizados no F. USDA-ARS arisanus operação de criação em Hilo, Havaí entre 05 de janeiro e 22 junho de 2010. Criação no local de Hilo na escala descrita neste artigo de vídeo e protocolo foi iniciado em agosto de 2009, e os problemas iniciais e ajustes com o novo local tinha sido na sua maioria resolvidos por janeiro. Portanto, estes dados são representativos dos resultados de outros pesquisadores podem obter a partir de sua colônia, se seguir o protocolo, conforme descrito e ter experiência de criação de insetos em geral. Durante este período, fomos mantendo uma pequena colônia de F. arisanus: 4 parasitóide gaiolas segurando produzidos por semana, equivalente a cerca de 3.600 F. arisanus.

Uma verificação inicial das taxas de parasitismo enriquecido foi conduzido tomando uma amostra de 2 g de pupas na faixa de tamanho de 1,65-2,26 mm (enriquecido), antes de mais uma semana de desenvolvimento em uma gaiola de retenção (isto é, imediatamente após a dieta larval foi removido e os pupas peneirado e tamanho classificadas. Referimo-nos a estas como 'pupas cedo "). Durante os primeiros três meses de 2010 os parasitas significa proporção na amostra enriquecida foi de 0,46 (DP = 0,18). Durante o trimestre seguinte esta média foi de 0,58 (DP = 0,08), refletindo a estabilização dos procedimentos e criação de colônias no novo local. Note-se que as pupas enriquecido, que não estavam parasitados com sucesso incluem aqueles que não produzem emergentes e aqueles que produziram as moscas.

Após mais uma semana na remoção gaiola realização de pupários vazios outra amostra de grama dois anos foi tomada ('pupas tarde'). Moscas da fruta representava menos de 1% desta amostra. O baixo percentual de moscas da fruta é parcialmente devido a com o anterior aparecimento de moscas em comparação com parasitas, assim a maioria voa permaneceu no recipiente de exploração.

Finalmente, a Figura 1 apresenta o rendimento em massa de pupa de janeiro a junho de 2010. Os rendimentos são medidos a partir de pupas enriquecido na faixa de tamanho de interesse, 1,65-2,26 mm. A grande massa de "início de pupas 'no início do ano indica uma alta proporção de moscas de frutas e pupas unemerged naquela época, enquanto que os ajustes foram sendo feitos para as novas instalações.

Figura 1. Rendimento de enriquecido (pupal diâmetro 1,65 2,26 milímetros) precoce (imediatamente após a seleção do tamanho) e 'atrasado' pupas (após a realização de uma semana e remover carcaças vazias) na ARS-USDA colônia ariasnus F. em Hilo, Hawaii , Janeiro - Junho 2010

Discussão

Neste artigo de vídeo protocolo e acompanhamento que temos descrito e demonstrado um protocolo otimizado para a criação de F. ariasnus, um parasitóide de moscas da fruta Tephritid, em um ambiente de laboratório. Este protocolo tem sido aperfeiçoado ao longo dos anos, para minimizar a quantidade de equipamentos de trabalho e especializado necessário para manter uma colônia. Notamos que uma bem estabelecida colônia, produtiva e estável de moscas da fruta host é necessária para qualquer tentativa de criação de parasitóides. No nosso insetário usamos Bactrocera dorsalis como uma mosca de fruta de acolhimento, mas outras espécies têm sido mostrados para ser os anfitriões competentes, bem ^14-17.

Vários aspectos da F. arisanus manutenção da colônia ainda precisam ser exploradas. Estes incluem a taxa de adaptação desta espécie de laboratório em ^{10 de} mecanismos de aprendizagem ²² e as mudanças genéticas que podem ocorrer com adaptação e mecanismos que podem estar envolvidos na plasticidade anfitrião mosca da fruta.

Nos últimos dez anos houve vários exemplos da propagação de moscas Dacine todo o mundo, em especial os da Bactrocera género: B. dorsalis na Polinésia Francesa, B. carambolae em partes da América do Sul, B. invadens na África e B. zonata na África e Mediterrâneo do Norte. Testing ^3,23,18 a eficácia dos agentes de controle biológico, como F. arisanus contra outras espécies Bactrocera deve ser uma alta prioridade, e é nossa esperança que a aplicação dos métodos descritos neste protocolo e artigo de vídeo que o acompanha, vai acelerar a pesquisa sobre F. arisanus em uma ampla variedade de locais ^24. Por fim, novas pesquisas utilizando este método como ponto de partida também pode fornecer informações importantes para a colonização de parasitóides de ovos romance ^25,1