Un protocollo ottimizzato per la cura dei Fopius arisanus, Un parassitoide di frutta Tephritid mosche

Riepilogo

Fopius arisanus è un uovo-parassitoide larvale di moscerini della frutta Tephritid che viene utilizzato con successo nel controllo biologico di questi parassiti importanti tropicale. Descriviamo qui un protocollo ottimizzato per l'allevamento di F. arisanus su piccola scala con materiali facilmente reperibili.

Abstract

Fopius arisanus (Sonan) è un importante parassitoide di moscerini della frutta Tephritid per almeno due ragioni. In primo luogo, è uno dei soli tre parassitoidi opiine noti per infettare l'ospite durante la fase di uovo ^1. In secondo luogo, ha una vasta gamma di potenziali ospiti moscerino della frutta. Forse a causa della sua storia di vita, F. arisanus è stato usato con successo per il controllo biologico dei moscerini della frutta in più regioni tropicali ^2-4. Un ostacolo per l'ampio uso di F. arisanus per il controllo della mosca della frutta è che è difficile stabilire una colonia stabile di laboratorio ^5-9. Nonostante questa difficoltà, nel 1990 i ricercatori dell'USDA messo a punto un metodo affidabile per mantenere le popolazioni di laboratorio di F. arisanus ^10-12. C'è notevole interesse in F. arisanus ^13,14 biologia, soprattutto per quanto riguarda la sua capacità di colonizzare una grande varietà di host Tephritid ^14-17; interesse è soprattutto guidato da l'allarmante diffusione di parassiti Bactrocera moscerino della frutta a nuovi continenti negli ultimi dieci anni ^18. Ulteriori ricerche su F. arisanus e ulteriori implementazioni di questa specie come agente di controllo biologico potranno beneficiare di ottimizzazioni e miglioramenti dei metodi di allevamento. In questo protocollo e video associati articolo viene descritto un metodo ottimizzato per l'allevamento di F. arisanus basato su un approccio descritto in precedenza ^12. Il metodo che descriviamo qui permette l'allevamento di F. arisanus in piccola scala senza l'uso di frutta, utilizzando materiali disponibili nelle regioni tropicali di tutto il mondo e con i requisiti manuale relativamente basso del lavoro.

Protocollo

1. Preparare le uova ospitare moscerino della frutta per parasitization

1. Preparare un substrato per le uova di mosca della frutta per essere parassitato da preparare agar (o in alternativa, Gelcarin GP812, FMC biopolimero, Ewing NJ; un'opzione più conveniente) piatti pieni, 10 cm di lunghezza per lato e 1,5 cm di profondità. Preparare agar ad una concentrazione di 9 g per litro di acqua.
2. Riempire i piatti fino al bordo con agar liquido (circa 70ml), e permettere loro di raffreddare e solidificare (almeno 45 minuti).
3. Una volta che i blocchi di agar sono solidi, applicare un unico strato di carta velina (un unico capo di tessuto lotto 'preferenza' Georgia Pacific), che coprono la parte superiore di ogni blocco. Il tessuto dovrebbe aderisce perfettamente alla agar a causa di umidità superficiale.
4. Applicare un volume di 0,5 ml uova di mosca della frutta sospese in acqua alla superficie del tessuto coperta dei blocchi agar. Nel nostro insectary, questo è equivalente a circa 6000 uova di Bactrocera dorsale (12000 uova per ml).
5. Utilizzare un panno pulito 2,5 centimetri largo pennello intinto in acqua per diffondere le uova di mosca della frutta in modo uniforme su tutta la superficie del tessuto.
6. Mettere le uova moscerino della frutta sotto lo schermo inferiore del parassitoide gabbie per consentire deposizione delle uova. Toccare la parte inferiore dello schermo in basso per rimuovere i parassiti morti che possono ostruire le uova. E 'meglio se lo schermo inferiore non tocca le uova.
7. Lasciare i parassiti di oviposit durante la notte e nel giorno successivo, circa 21 ore. Questo è un tempo sufficiente per una percentuale elevata delle uova da parassitati. Più superparasitization esposizione rischi.

2. Cova e impupamento di frutta ospitare parassitati vola

1. Preparare allevamento contenitore mettendo 3-3,5 blocchi agar preparata di uova parassitizzate per 1,25 litri di dieta mosca della frutta ¹⁹ con uova verso l'alto.
2. Posizionare il contenitore dieta con le uova su un montante sopra uno strato di 1,5 centimetri di profondità vermiculite grado fine o sabbia lavata in un contenitore impupamento più grande. Coprire il recipiente con un coperchio impupamento e nastro i bordi con del nastro adesivo. Vermiculite può essere riutilizzato dopo vagliatura (vedi sotto).
3. Accertarsi che vi sia spazio sufficiente tra la parte superiore del contenitore dieta e il coperchio del contenitore impupamento per le larve mosca della frutta a strisciare fuori e 'pop' ²⁰ nel vemiculite sottostante.
4. Spostare i contenitori impupamento in una stanza a 27 ° C e 80% di umidità relativa (RH) per una settimana. Contenitori Coprire con un panno scuro per i primi quattro giorni, per poi togliere il panno per i giorni rimanenti.
5. Rimuovere dieta larvale dopo una settimana, una volta che le larve hanno schioccato ed è entrato nella vermiculite per impupamento. Se ci sono le larve nel vermiculite, permettere loro di pupate durante la notte.
6. Setacciare la pupe dalla vermiculite. Inizia con un setaccio grossolano (circa 3 mm), quindi usare un setaccio a mano per eliminare eventuali grumi rimasti di vermiculite.

3. Ordinamento e selezione

1. Pupa contenenti F. arisanus può essere parzialmente separati dai moscerini della frutta unparasitized per dimensione. Raccogliere pupa tra mm 1,65 e 2,26 di diametro, in quanto questi sarà arricchita per le mosche parassitati ^12. Puparia che sono più piccole contengono per lo più parassitoidi sottodimensionato, maggiore pupa contengono per lo più mosche. Si noti inoltre che per le pupe parassitati la percentuale di femmine correla positivamente con la dimensione ^12.
2. Una varietà di metodi possono essere utilizzati per ordinare pupe per dimensione. Ci descrive un metodo meccanico utilizzando un formato personalizzato sorter ^21.
3. Luogo pupe nell'imbuto in alto di un alimentatore di vibrazione che alimenta lentamente il selezionatore dimensioni.
4. Alimentare le pupe in selezionatrice dimensioni, che consiste in una coppia di barre rotolamento leggermente divergenti con un angolo di 30 °. Il calo pupe individualmente in base alle dimensioni in un array di slot vuoti che in dieci contenitori separati attraverso un imbuto.
5. Raccogliere pupe dalle coppe nella gamma di dimensioni di 1,65 2,26 millimetri e metterli in una gabbia di emergenza per 7 giorni in più fino a quando la maggior parte le mosche sono emersi dalle pupe unparasitized.
6. Successivamente, utilizzare un ventilatore per separare puparia vuote da quegli insetti ancora contiene.

4. F. arisanus emergere e manutenzione

1. Per mantenere la colonia di F. arisanus utilizzare una gabbia parassitoide holding con una facciata in vetro rimovibile, circa 25 cm di lunghezza per lato. La gabbia ha 1mm ² di screening sulla parte superiore e due dei lati. La parte posteriore della gabbia viene ricoperta da un foglio di gomma con un foro di 9 centimetri per l'accesso. Il fondo della gabbia ha un taglio fuori coperta nella parte interna con 1-2mm ² schermo grande abbastanza per permettere il posizionamento di due blocchi agar con le uova mosca della frutta per la deposizione delle uova parassitoide.
2. Le gabbie azienda deve anche avere una parte colorata lungo la parte inferiore del quarto anteriore in vetro per ridurre al minimo la luce che può creare affollamento parassitoide lungo la parte anteriore della gabbia, con conseguente elevata mortalità.
3. Mettere circa 11 g di queste selezioniTed pupe in contenitori in plastica di circa 9 cm di diametro. Questo dovrebbe produrre circa 600-700 parassiti per gabbia. Selezione del formato dovrebbe portare a circa il 60% donne.
4. Fissare i coperchi proiettato ai contenitori. I coperchi devono essere coperti con 2 mm ² di screening, che permetterà adulti F. arsianus di lasciare i contenitori su emergere ma, conterrà alcun moscerini della frutta rimanenti.
5. Mantenere i parassiti a 24 ° C e circa il 45% di umidità relativa, con una ventilazione 12:12 fotoperiodo e buono. Se la mortalità elevata si osserva, spostando le gabbie all'aperto per alcune ore al giorno o ventilazione aumentando può ridurre. I parassiti dovrebbero essere pronti a oviposit in una settimana supplementare e deve essere produttivo per altre due settimane.
6. Streak non diluito il miele filato lungo la parte superiore delle gabbie almeno tre volte alla settimana o ogni volta che il miele è disponibile a secco. Applicare il miele filato in strisce strette con un dito. Si noti che se le strisce sono troppo pesanti il ​​miele sarà flebo in gabbia, se troppo chiaro il miele si asciuga rapidamente e richiedono riapplicazione frequente.
7. Luogo blocchi agar (10 cm x 10 cm x 4 cm) sulle cime delle gabbie di fornire umidità per i parassiti. Questi dovrebbero essere cambiati due volte alla settimana.

5. Rappresentante dei risultati:

Riportiamo qui i risultati di procedure di controllo qualità condotti sulla USDA-ARS F. arisanus operazione allevamento a Hilo, Hawaii tra il 5 gennaio e 22 giugno 2010. L'allevamento nella posizione Hilo sulla scala descritto in questo articolo il video e il protocollo è stato avviato nel mese di agosto 2009, ed i problemi iniziali e regolazioni con la nuova posizione era stata per lo più risolto da gennaio. Pertanto, questi dati sono rappresentativi dei risultati di altri ricercatori potrebbero ottenere iniziano la loro colonia, se seguire il protocollo come descritto e hanno esperienza di allevamento di insetti in genere. In questo periodo siamo stati mantenendo una piccola colonia di F. arisanus: 4 gabbie parassitoide tenendo prodotte a settimana, equivalenti a circa 3600 F. arisanus.

Una prima verifica dei tassi di parasitization arricchito è stato condotto prendendo un campione di 2 g di pupe nella gamma di dimensioni di 1,65-2,26 mm (arricchito) prima di una settimana supplementare di sviluppo in una gabbia holding (cioè immediatamente dopo la dieta larvale è stato rimosso e il pupe setacciata e le dimensioni ordinati. Ci riferiamo a questi come 'pupe presto'). Durante i primi tre mesi del 2010 i parassiti proporzione media del campione è stato arricchito 0,46 (SD = 0,18). Durante il trimestre successivo questa media è stata di 0,58 (DS = 0,08), riflettendo la stabilizzazione delle procedure e l'allevamento in colonia nella nuova posizione. Si noti che le pupe che non sono stati arricchiti con successo parassitati comprendono quelli che non hanno prodotto emergenti e quelli che hanno prodotto le mosche.

Dopo un'ulteriore settimana per la rimozione gabbia svolgimento di puparia vuoto altri due grammi del campione è stata presa ('pupe fine'). Moscerini della frutta rappresenta meno dell'1% di questo secondo campione. La bassa percentuale di moscerini della frutta è in parte dovuto alla all'emergere di mosche in precedenza rispetto ai parassiti, per cui la maggior parte vola rimasto nel contenitore azienda.

Infine, la Figura 1 fornisce la resa in massa pupa da gennaio a giugno 2010. I rendimenti sono misurati dal pupe arricchita nella gamma di dimensioni di interesse, 1,65-2,26 mm. La grande massa di "pupe precoce" all'inizio dell'anno indica una percentuale elevata di moscerini della frutta e pupe unemerged in quel momento, mentre sono stati applicati adeguamenti da apportare al nuovo impianto.

Figura 1. Resa arricchito (diametro pupa 1,65 2,26 millimetri) precoce (immediatamente dopo la selezione del formato) e 'in ritardo' (dopo aver tenuto per una settimana e la rimozione di involucri vuoti) pupe al USDA-ARS colonia F. ariasnus a Hilo, Hawaii , gennaio - giugno 2010

Discussione

In questo articolo video di protocollo e di accompagnamento che abbiamo descritto e dimostrato un protocollo ottimizzato per l'allevamento di F. ariasnus, un parassitoide di moscerini della frutta Tephritid, in un ambiente di laboratorio. Questo protocollo è stato affinato negli anni per ridurre al minimo la quantità di lavoro e attrezzature specialistiche necessarie per mantenere una colonia. Prendiamo atto che una ben consolidata, produttiva e stabile colonia di moscerini della frutta host è richiesto per qualsiasi tentativo di parassitoidi allevamento. Nel nostro insectary usiamo Bactrocera dorsale come un moscerino della frutta di accoglienza, ma altre specie hanno dimostrato di essere ospiti competenti e ^14-17.

Diversi aspetti di F. manutenzione colonia arisanus rimangono da esplorare. Questi includono la velocità di adattamento in questa specie di laboratorio ^10, meccanismi di apprendimento ²² e le mutazioni genetiche che possono verificarsi con l'adattamento e meccanismi che possono essere coinvolte nella plasticità moscerino della frutta host.

Negli ultimi dieci anni ci sono stati numerosi esempi della diffusione di mosche Dacine in tutto il mondo, in particolare quelli del genere Bactrocera: B. dorsale in Polinesia Francese, B. carambolae in alcune parti del Sud America, B. invadens in Africa e B. zonata in Africa e Mediterraneo settentrionale. ^3,23,18 prova l'efficacia degli agenti di controllo biologico, come F. arisanus nei confronti delle altre specie di Bactrocera dovrebbe essere una priorità, ed è nostra speranza che l'applicazione dei metodi descritti in questo articolo protocollo e video di accompagnamento, accelererà la ricerca su F. arisanus in una più ampia varietà di punti ^24. Infine, ulteriori ricerche con questo metodo come punto di partenza può anche fornire informazioni importanti per la colonizzazione di parassitoidi uovo romanzo ^25,1