Оптимизированный протокол для разведения Fopius arisanus, Паразитоид из Tephritid плодовых мух

Резюме

Fopius arisanus является яичный личиночной паразитоид из Tephritid плодовых мух, которые успешно применяются в биологической борьбе с этим важным тропических насекомых-вредителей. Мы описываем здесь оптимизированный протокол для выращивания F. arisanus в небольших масштабах с помощью легко доступных материалов.

Аннотация

Fopius arisanus (Sonan) является важным паразитоид из Tephritid плодовых мух в течение по крайней мере по двум причинам. Во-первых, это одна из трех opiine паразитоидов инфицируют хоста на стадии яйца ^1. Во-вторых, она имеет широкий диапазон потенциальных хозяев плодовых мух. Возможно, из-за его историю жизни, Ф. arisanus были успешно использованы для биологической борьбы с плодовой мухи во многих тропических областях ^2-4. Одним из препятствий для широкого использования F. arisanus для фруктов контроль муха, что трудно установить стабильные колонии лаборатории ^5-9. Несмотря на эти трудности, в 1990-х исследователи USDA разработан надежный способ сохранить лабораторных популяциях F. arisanus ^10-12. Существует значительный интерес в F. arisanus биологии ^13,14, особенно в отношении его способности колонизировать широкий спектр Tephritid хостов ^14-17; интерес особенно обусловлено тревожной распространения вредителей Bactrocera плодовой мушки на новые континенты в последнее десятилетие ^18. Дальнейшие исследования на F. arisanus и дополнительное развертывание этого вида в качестве агента биологической борьбы выиграют от оптимизации и улучшения воспитания методами. В этом протоколе и связанные с видео статье мы расскажем оптимизированный метод воспитания F. arisanus на основе описанных выше подхода ^12. Метод, который мы здесь описывать позволяет воспитание F. arisanus в небольшом масштабе, без использования фруктов, с использованием материалов, имеющихся в тропических регионах по всему миру и с относительно низкими требованиями к физическому труду.

протокол

1. Подготовка хоста яйца дрозофилы для паразитирования

1. Подготовка субстрата для плодовой мушки яйца должны быть паразитирует подготовке агар (в качестве альтернативы Gelcarin GP812, FMC биополимеров, Юинга штат Нью-Джерси, более экономически эффективным вариантом), заполненной блюд, 10 см в длину с каждой стороны и 1,5 см глубиной. Подготовка агара с концентрацией 9 г на литр воды.
2. Заполните блюда к краю с жидким агаром (примерно 70 мл), и дать им остыть и закрепить (не менее 45 минут).
3. Как только агар блоки твердого, применить один слой тонкой бумаги (однослойный пакетной ткани "Предпочтение" Грузия Тихого океана), покрытие верхней части каждого блока. Ткани должны придерживаться легко агар из-за поверхностной влаги.
4. Применяют 0,5 мл объема плодовой мушки яиц, взвешенных в воде ткань покрыта поверхность агара блоков. В нашем insectary, это эквивалентно около 6000 яиц Bactrocera спинной (12000 яиц в мл).
5. Используйте чистую 2,5 см широкой кистью, смоченной в воде распространяться яйца дрозофилы равномерно по поверхности ткани.
6. Место плодовой мухой яиц под днищем экране паразитоид клетки, чтобы яйцекладки. Нажмите на нижней стороне нижней части экрана, чтобы удалить мертвые паразиты, которые могут препятствовать яйца. Лучше всего, если в нижней части экрана не касается яиц.
7. Разрешить паразиты откладывают яйца на ночь и на следующий день, около 21 часов. Это достаточное время для большой процент яиц быть зараженные. Более длинные экспозиции риски superparasitization.

2. Штриховка и окукливания зараженных фруктов хост мух

1. Подготовка воспитания контейнера путем размещения от 3 ​​до 3,5 подготовлены блоки агар зараженных яиц в 1,25 литра плодовой мушки диете ¹⁹ с яйцами вверх.
2. Место диеты контейнер с яйцами на стояке более 1,5 см в глубину слой мелкого вермикулита класса или промытого песка в больших окукливания контейнер. Обложка окукливания контейнер с крышкой и лентой края с клейкой лентой. Вермикулит может быть повторно использован после просеивания (см. ниже).
3. Убедитесь, что имеется достаточно места между верхней частью диеты контейнер и крышка контейнера для окукливания личинок мух фрукты вылезти и "поп" в ²⁰ vemiculite ниже.
4. Перемещение контейнеров для окукливания комнате при 27 ° С и 80% относительной влажности (RH) на одну неделю. Крышка контейнера с темной тканью в течение первых четырех дней, после чего удалить ткань для оставшихся дней.
5. Удалить личиночной диета через неделю, когда личинки выскочил и вошел вермикулита для окукливания. Если Есть личинок в вермикулит, позволяют им окукливаются в одночасье.
6. Сито куколки из вермикулита. Начните с сито с крупными отверстиями (около 3 мм), то пользуйтесь сито, чтобы удалить оставшиеся сгустки вермикулит.

3. Сортировка и отбор

1. Куколка, содержащих F. arisanus может быть частично отделяются от плодовых мух unparasitized по размеру. Сбор куколки между 1,65 и 2,26 мм в диаметре, так как они будут обогащенные для зараженных мух. ¹² Пупарии которые меньше содержат в основном низкорослые паразитоидов, большие куколки содержат в основном мух. Отметим также, что для зараженных куколки процент женщин положительно коррелирует с размером ^12.
2. Различные методы могут быть использованы для сортировки куколки по размеру. Мы опишем метод с использованием механических нестандартного размера сортировщик ^21.
3. Место куколок в воронку в верхней части вибрации питателя, который медленно кормит размер сортировщика.
4. Поток куколки в размере сортировщик, который состоит из пары слегка расходящиеся прокатки полосы в угол 30 °. Куколки падение индивидуально по размеру в массив слотов, которые впадают в десяти отдельных контейнеров через воронку.
5. Сбор куколки из чашки в диапазоне размеров от 1,65 до 2,26 мм и поместить их в клетку для появления еще 7 дней, пока большинство мух вышли из unparasitized куколок.
6. Затем с помощью вентилятора отделить пустые пупарии из тех, кто еще содержащие насекомых.

4. F. arisanus возникновения и поддержания

1. Для поддержания колонию F. arisanus использовать паразитоид проведения клетке со съемной передней стекло, примерно 25 см в длину с каждой стороны. Клетка имеет 1 мм ² скрининга на верхней и двух сторон. Задней клетке кроется в резиновый лист с 9 см отверстие для доступа. Дно клетки имеет вырезать покрытые с внутренней стороны с 1-2мм ² экран достаточно большой, чтобы позволить размещение двух блоков агар с плодовой мухой яиц паразитоид яйцекладки.
2. Проведение клетки также должны иметь тонированные части вдоль нижней четверти переднее стекло, чтобы минимизировать света, который может создать паразитоид скученности вдоль передней части клетки, что приводит к повышенной смертности.
3. Поместите приблизительно 11 г этих отборТед куколки в пластиковые контейнеры около 9 см в диаметре. Это должно произвести около 600-700 паразитов в клетке. Размер отбор должен привести к примерно 60% женщин.
4. Прикрепите экранированный крышки для контейнеров. Крышки должны быть покрыты ² мм 2 скрининг, который позволит взрослым F. arsianus оставить контейнеров при выходе, но будет содержать все оставшиеся мухи.
5. Поддерживать паразитов при 24 ° С и около 45% относительной влажности с 12:12 фотопериода и хорошая вентиляция. Если высокая смертность наблюдается, двигаясь клетках на открытом воздухе в течение нескольких часов в день или увеличения вентиляции может уменьшить его. Паразиты должны быть готовы откладывать яйца в одной дополнительной недели и должны быть продуктивными в течение еще двух недель.
6. Подряд неразбавленном нити меда в верхней части клетки не реже трех раз в неделю или всякий раз, когда доступны мед сухой. Применение центробежного меда в узких полос использованием пальца. Заметим, что если полосы являются слишком тяжелыми мед будет капать в клетку, а если слишком светлый мед высохнет быстро и требуют частой повторное.
7. Место агар блоков (10 см х 10 см х 4 см) на вершинах клетки обеспечить влагой паразитов. Они должны быть изменены в два раза в неделю.

5. Представитель Результаты:

Мы сообщаем о результатах процедур контроля качества проводятся на USDA-ARS F. arisanus воспитания эксплуатацию в Хило, Гавайи в период с января 5 и 22 июня 2010 года. Воспитание по месту нахождения Хило на шкале, описанные в этой статье видео и протокол был начат в августе 2009 года, и первоначальные проблемы и корректировки, новое место, носили в основном решена к январю. Таким образом, эти данные являются репрезентативными результатами других исследователей, могли бы получить, начиная свою колонию, если они следуют протокола, как это описано у насекомых и опыт воспитания в целом. За это время мы были поддержания небольшая колония F. arisanus: 4 паразитоид проведения клетки производятся в неделю, что эквивалентно примерно 3600 F. arisanus.

Первоначальная проверка ставок обогащенного паразитирование был проведен с 2 г образца куколок в диапазоне размеров от 1,65 - 2,26 мм (обогащенный) до одной дополнительной недели развития холдинга клетки (то есть сразу после личиночной диета была удалена и куколки просеянной и размер отсортированы. Мы называем это «ранние куколки"). В течение первых трех месяцев 2010 года средняя доля паразитов в образец обогащенного был 0,46 (SD = 0,18). В течение следующего квартала это значит был 0,58 (SD = 0,08), что отражает стабилизацию колонии и воспитания процедур на новом месте. Обратите внимание, что куколки обогащенного которые не были успешно зараженные включают те, которые не дали полупогруженными и те, которые производятся мух.

После дополнительной недели в проведении клетке удаление пустых пупарии еще два грамма отбора пробы («позднего куколки"). Плодовые мушки представлены до 1% от этого второго образца. Низкий процент плодовых мушек, частично в связи с более ранним появлением мух по сравнению с паразитами, так что большинство мух остались в проведении контейнер.

Наконец, на рисунке 1 дает выход в массы куколки с января по июнь 2010 года. Дает измеряются из куколок обогащенный диапазон размеров интересов, 1.65-2.26 мм. Большой массы "раннего куколки" в начале года, свидетельствует о высокой доли плодовых мушек и unemerged куколки в то время, в то время корректировки были внесены в новое помещение.

Рисунок 1. Доходность обогащенного (куколки диаметром 1.65-2.26mm) рано (сразу после выбора размера) и "поздний" (после проведения в течение одной недели и удаление пустых корпусов) куколки на ARS-USDA колонии Ф. ariasnus в Хило, Гавайи , январь - июнь 2010

Обсуждение

В этой статье видео протокол и сопутствующие мы описали и показали, оптимизированный протокол для выращивания F. ariasnus, паразитоид из Tephritid плодовых мух, в лабораторных условиях. Этот протокол был усовершенствован за эти годы, чтобы минимизировать количество оборудования, трудовых и специализированных, необходимых для поддержания колонии. Отметим, что также установлено, продуктивной и стабильной колонии мух хост плоды, необходимые для любой попытки выращивания паразитоидов. В нашем insectary мы используем Bactrocera спинной как плодовая муха хозяина, но и других видов было показано, что компетентные хостов, а ^14-17.

Некоторые аспекты F. arisanus колонии обслуживания еще предстоит исследовать. К ним относятся скорость лаборатории адаптации у данного вида ^10, механизмы обучения ²² и генетические изменения, которые могут возникнуть при адаптации и механизмы, которые могут быть вовлечены в принимающих пластичности плодовой мухи.

За последние десять лет произошли многочисленные примеры распространения мухи Dacine во всем мире, особенно в род Bactrocera: Б. спинной во Французской Полинезии, Б. carambolae в некоторых частях Южной Америки, Б. invadens в Африке и B. zonata в Африке и Северного Средиземноморья. ^3,23,18 Тестирование эффективности биологических средств контроля, таких как Ф. arisanus против других видов Bactrocera должно быть высоким приоритетом, и мы надеемся, что применение методов, описанных в данном протоколе и сопровождающие статью видео, позволит ускорить исследования по Ф. arisanus в более широком различных местах ^24. Наконец, дальнейшие исследования с помощью этого метода в качестве отправной точки также могут предоставить важную информацию для колонизации паразитоидов роман яйцо ^25,1