Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Resumo

Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.

Resumo

O cromossoma bacteriano pode ser utilizado para manter de forma estável de ADN estranho na gama mega-base ^1. Integração no cromossoma contorna questões tais como a replicação do plasmídeo, a estabilidade do plasmídeo, a incompatibilidade do plasmídeo, e variância número plasmídeo de cópia. Este método utiliza a integrase site-specific a partir do fago de Streptomyces (Φ) C31 ^2,3. A integrase ΦC31 catalisa uma recombinação direta entre dois sítios de DNA específicas: attB e attP (34 e 39 pb, respectivamente) ^4. Esta recombinação é estável e não revertem ^5. A "pista" sequência (LP), constituído por um gene de resistência à espectinomicina, aadA (SPR), ea E. gene coli ß-glucuronidase (uidA) ladeado por sites attP foi integrado nos cromossomos de Sinorhizobium meliloti, anthropi Ochrobactrum e Agrobacterium tumefaciens em uma região intergênica, a ampC locus, eo locus Teta, respectivamente. S. meliloti é usado neste protocolo. Vectores de dadores contendo locais attB mobilizável que flanqueiam um stuffer vermelho fluorescente proteína do gene (SDP) e um gene de resistência a antibiótico também têm sido construída. Neste exemplo, o pJH110 resistente gentamicina plasmídeo é usado. O gene rfp ⁶ pode ser substituída com uma construção desejada utilizando Sph I e Pst I. Alternativamente um construto sintético flanqueado por sítios attB podem ser sub-clonado num vector mobilizável, tais como pK19mob ^7. A expressão do gene da integrase ΦC31 (clonado a partir de pHS62 ⁸⁾ é conduzida pelo promotor lac, em uma ampla gama de hospedeiros mobilizável plasmídeo pRK7813 ^9.

Um protocolo de acasalamento tetraparental é usado para transferir a cassete de doador na estirpe LP substituindo assim os marcadores na sequência de LP com a cassete de dador. Estas células são trans-integrantes. Trans-integrantes são formados com uma eficiência típica de 0,5%. Trans-integrantes são tipicamente encontrados nos primeiros 500-1,000 colónias filtradas através da sensibilidade aos antibióticos ou azul-branco rastreio utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucurónico ácido (X-gluc). Este protocolo contém os procedimentos de acasalamento e de seleção para criar e isolar trans-integrantes.

Protocolo

1. Produção de Cultura

1. Preparar meios líquidos estéreis: TY ¹⁰ (5 g / l de triptona, extracto de levedura 3 g / l, 0,44 g / l de cloreto de cálcio hidratado), e LB ¹¹ (10 g / l de triptona, 5 g de extracto de levedura / l, 5 g / cloreto de sódio, pH 7).
2. Inocular a partir de uma única colônia: SmUW227 (S. meliloti LP-deformação: a construção será descrito em outro lugar, a estirpe detalhes de construção disponíveis mediante solicitação) () em 5 ml de TY media com 50 mg / ml espectinomicina. Inocular as seguintes estirpes em 5 ml de meio líquido LB, que complementa com o antibiótico dado: E. coli DH5a ¹² contendo pJC2, a expressão da integrase plasmídeo, com 10 ug / ml de tetraciclina; E. coli MT616 ^13, o mobilizador, com 10 ug / ml de cloranfenicol; e E. coli DH5a contendo pJH110, a cassete de plasmídeo dador, com 5 ug / ml de gentamicina.
3. Incubar E. cepas de Escherichia durante a noite a 37 e°; C com agitação constante. Incubar S. meliloti estirpe a 30 ° C durante dois dias, com agitação. É possível obter uma S. meliloti cultura durante a noite com uma maior inoculo (1:500 subcultura de uma cultura saturada).

2. Preparação Cultura e Mixing

1. Lavar 1,5 ml de cultura para cada estirpe, recolhendo o sedimento de células por centrifugação a 17.000 xg durante 30 segundos e ressuspensão em 1 ml estéril NaCl 0,85%; repetição uma vez.
2. Ressuspender o sedimento em 100 uL de estéril NaCl 0,85%.
3. Individualmente manchar 10 ul de cultura lavada para cada estirpe em uma placa de agar TY liso. Estes pontos são pontos de controle.
4. Adicionar 40 ul de cada estirpe excluindo a E. coli DH5a ¹² contendo pJC2 num tubo estéril, mistura, e uL local 120 desta mistura sobre uma placa de agar TY liso. Este ponto é o controle não integrase-negativo.
5. Adicionar 40 ul de cada estirpe em um t estérilube, misturar, e ponto 160 ul desta mistura em um prato simples de ágar TY. Este ponto é o local de acasalamento IMCE.
6. Permitir pontos para secar em uma capela de fluxo laminar.
7. Placas de vedação e incubar a 30 ° C durante a noite.

3. Isolamento de Trans-integrantes

1. Manchas de registo contínuo de controlo e no local IMCE em placas de agar TY suplementado com 200 ug / ml de estreptomicina (SmUW227 baseia-se na Rm1021 que transporta uma mutação que confere alto nível de resistência à estreptomicina ¹⁴⁾ e gentamicina 30 ug / ml.
2. Para o cálculo da eficiência IMCE, ressuspender aproximadamente ¼ do local de acasalamento IMCE em 500 ul de NaCl 0,85% estéril. Fazer 10 diluições em série de 10 ^-7. Diluições placa 10 por meio de 10 ^{-5 -2} em placas de agar TY suplementado com 200 ug / ml de estreptomicina e 30 ug / ml de gentamicina, à selecção de trans-integrantes. Diluições placa 10 thr ^-3ough 10 ^-7 em placas de agar TY suplementado com 200 ug / ml de estreptomicina, para seleccionar para ambos os trans-integrantes e potenciais receptores, isto é, receptores totais.
3. Para o isolamento de markerless trans-integrantes ressuspender aproximadamente um quarto do local de acasalamento IMCE em 500 uL de estéril NaCl 0,85%. Fazer 10 diluições em série de 10 ^-6. Diluições placa 10 ^-4 a 10 ^-6 em quatro placas de agar TY suplementado com 200 ug / ml de estreptomicina e 200 ug / ml X-gluc.
4. Incubar as placas a 30 ° C durante 3 dias.
5. Visualização RFP trans-integrantes sob luz verde (525 nm) e através de um filtro vermelho (> 610 nm) ^15.
6. Calcula-se a eficiência IMCE por cento como CFU de trans-integrantes em comparação com o CFU de destinatários totais. Cerca de metade dos trans-integrantes terão sofrido troca cassete verdadeiro tornando-os brancos e espectinomicina sensível.
7. Para encontrar os markerless trans-integrantes (waqui o vector dador não contém Gm ^r como em pJH110) tela para uma colónia branca (um período de incubação prolongada, 1-2 dias adicionais à temperatura ambiente, irá aumentar a diferenciação de colónias por meio de X-gluc, isto é necessário em S. meliloti SmUW227), confirmar a sensibilidade da colónia espectinomicina por triagem de uma placa de agar TY sem antibióticos e uma placa de agar TY contendo 100 ug / ml espectinomicina.

4. Os resultados representativos

Após três dias de incubação em TY suplementado com estreptomicina e gentamicina as estrias de controlo deve ter nenhum crescimento. A raia IMCE deve ter crescimento confluente na raia cabeça e muitas colónias sobre o segundo raia, como visto na Figura 2. A eficiência da integração-trans, expresso como a percentagem de trans-integrantes aos destinatários totais, deve estar no intervalo de 0,5%. Cerca de metade dos trans-integrantes será espectinomicina sensível e brancomostrando que eles foram submetidos a troca de cassetes verdade. Trans-integrantes contendo o testador cassete doador rfp de pJH110 deve exibir fluorescência RFP perceptível quando visto sob luz verde (525 nm) e através de um filtro vermelho (> 610 nm) ^15.

. Figura 1 ilustração mistura Conjugação: Aided pela expressão dos genes de transferência de pRK600, todos os plasmídeos são transferidos aleatoriamente a partir de célula para célula. Esta transferência resulta na criação de trans-integrantes na mistura, por meio de aquisição da estirpe LP-de os dois plasmídeos necessários para IMCE, a integrase (int) pJC2 plasmídeo ajudante eo pJH110 plasmídeo dador. A cassete de dador, do dador não-replicante plasmídeo (pJH110) é transferida através de ΦC31 actividade da integrase com os marcadores do LP-cassete no cromossoma, resultando na perda do LP-marcadores (Sp^R e uidA) e para a manutenção da cassete de dador (rfp e GM ^r) na resultante trans-integrante.

Figura 2. A: B placa de acoplamento mancha sobre uma placa de TY não selectivo mostrando misturas de células secas na superfície de agar:. Manchas listras de acoplamento na placa de estreptomicina-gentamicina-X-gluc, a partir de topo esquerdo no sentido horário nenhum controlo integrase, IMCE em S. meliloti, E. coli DH5a contendo controle pJC2, E. coli DH5a contendo pJH110 controlo, E. controle coli MT616, e S. . meliloti controle UW227 C: 10 diluição ^-2 de ressuspensão local de acasalamento em TY estreptomicina-X-agar glic D: 10. diluição ^-2 de ressuspensão local de acasalamento em ágar TY-estreptomicina gentamicina-X-glic (colônias azuis são recombinantes individuais, colônias brancas foram submetidos a verdadetroca cassete) E: 10. diluição ^-2 de ressuspensão acasalamento mancha na TY agar estreptomicina-X-gluc mostrando a falta de fluorescência F: 10. diluição ^-2 de ressuspensão local de acasalamento em agar TY-estreptomicina gentamicina-X-gluc mostrando dois níveis de fluorescência (colônias brilhantes correspondem a colônias azuis e têm maior expressão rfp presumivelmente devido ao promotor de leitura que a partir de seqüência do vetor, onde colônias ter sido submetido a verdadeiro troca-cassete conter RFP com apenas promotor sua imediata sem leitura por meio do promotor lac em o vector, que está ausente.).

Discussão

A técnica IMCE permite a eficiente integração de uma cassete de ADN único attB flanqueada no LP-locus de uma estirpe previamente manipulada. Uma vez que a construção desejada é clonado no lugar de rfp para criar a cassete de dador, a técnica não requer purificação de ADN e transformação subsequente, o que torna muito robusta. É crítico que controla o crescimento adequados estão incluídos, para ser determinada a resistência a antibióticos é devido à criação de trans-integrantes e ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Estreptomicina	Bioshop Canada Inc.	STP101
Espectinomicina	Bioshop Canada Inc.	SPE201
Gentamicina	Bioshop Canada Inc.	GTA202
Choramphenicol	Bioshop Canada Inc.	CLR201
Tetraciclina	Bioshop Canada Inc.	TET701
Canamicina	Bioshop Canada Inc.	KAN201
Agar grau bacteriológica	Bioshop Canada Inc.	AGR001
Triptona	Bioshop Canada Inc.	TRP402
Extracto de levedura	Bioshop Canada Inc.	YEX401
Cloreto de Sódio	Bioshop Canada Inc.	SOD001
Cloreto de cálcio	Bioshop Canada Inc.	CCL444
X-gluc	Ouro Biotecnologia Inc.	G1281C1
E. coli estirpe MT616	Disponível em cima do pedido		Também é usado fora do nosso laboratório
E. coli estirpe pJC2	Em casa, disponíveis mediante solicitação
E. coli estirpe pJH110	Em casa, disponível por Request
SmUW227 tensão	Em casa, disponíveis mediante solicitação