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Method Article
Eine schnelle und effiziente Methode, um Fremd-DNA von Interesse in vorgefertigte Akzeptor Stämme, sogenannte Landing-Pad-Stämme, die Integration beschrieben wird. Das Verfahren erlaubt eine ortsspezifische Integration eines DNA-Kassette in die gentechnisch Landeplatz Ort einer gegebenen Dehnung, durch Konjugation und Expression des ΦC31 Integrase.
Die Bakterien-Chromosom kann verwendet werden, um stabil zu halten Fremd-DNA in der Mega-Basen-Bereich 1 werden. Integration in das Chromosom umgeht Themen wie Plasmidreplikation, der Stabilität von Plasmiden, Plasmid Inkompatibilität und Plasmid-Kopienzahl Varianz. Diese Methode verwendet die ortsspezifische Integrase aus dem Streptomyces Phagen (Φ) C31 2,3. Die Integrase katalysiert ΦC31 eine direkte Rekombination zwischen zwei spezifischen DNA-sites: attB und attP (34 und 39 bp) 4. Diese Rekombination ist stabil und nicht zurückkehren 5. Ein "Landeplatz" (LP)-Sequenz bestehend aus einer Spectinomycin-Resistenz-Gen, aadA (SPR) und der E. coli ß-Glucuronidase-Gen (uidA) von attP flankiert in die Chromosomen der Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi und Agrobacterium tumefaciens in einem Zwischengenregion integriert wurde, bin daspC Locus und die tetA Locus, jeweils. S. meliloti ist in diesem Protokoll verwendet. Mobilisierbaren Vektoren, die Donor attB flankieren eine Stuffer rot fluoreszierendes Protein (RFP)-Gen und ein Antibiotika-Resistenz-Gen wurde ebenfalls konstruiert. In diesem Beispiel wird Gentamicin resistente Plasmid pJH110 verwendet wird. Der RFP-Gen 6 kann mit einem gewünschten Konstrukt mit Sph I und Pst I ersetzt werden Alternativ kann ein synthetisches Konstrukt von attB-Stellen flankiert sein können subkloniert in einen mobilisierbaren Vektor wie pK19mob 7. Die Expression des Integrase-Gens ΦC31 (kloniert von pHS62 8) durch den lac-Promotor angetrieben wird, auf einem mobilisierbaren Plasmids mit breitem Wirtsbereich pRK7813 9.
Ein tetraparental passenden Protokoll wird verwendet, um den Spender Kassette in der LP-Stamm und ersetzt die Marker in der LP-Sequenz mit der Donor-Kassette zu übertragen. Diese Zellen sind trans-Integranten. Trans-Integranten werden mit einem typischen Wirkungsgrad von 0,5% gebildet. Trans-Integranten werden typischerweise innerhalb der ersten 500-1,000 Kolonien durch Antibiotika-Empfindlichkeit oder blau-Weiß-Screening unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-Glucuronsäure (X-gluc) gescreent vorhanden. Dieses Protokoll enthält die Paarungs-und Auswahlverfahren für das Erstellen und Isolieren von trans-Integranten.
1. Die Produktion von Kultur
2. Kultur Vorbereitung und Mixing
3. Isolierung von Trans-Integranten
4. Repräsentative Ergebnisse
Nach drei Tagen Inkubation auf TY mit Streptomycin und Gentamicin die Kontrolle Streifen sollte kein Wachstum. Die Streifen sollten IMCE konfluenten Wachstums auf dem Kopf Streifen und viele Kolonien auf dem zweiten Streifen, wie in 2 zu sehen. Die Effizienz des Transports Integration, als der Prozentsatz von trans-Integranten zu insgesamt Empfänger exprimiert, sollte im Bereich von 0,5%. Etwa die Hälfte der trans-Integranten wird Spectinomycin empfindliche und weißzeigen sie wahre Kassette Austausch unterzogen. Trans-Integranten, die die Tester RFP Spender Kassette aus pJH110 anzeigen soll erkennbar RFP Fluoreszenz, wenn sie unter grünem Licht (525 nm) und durch einen roten Filter (> 610 nm) 15 angesehen.
. 1 Konjugieren Mischung Darstellung: Mit Hilfe der Expression der Gene aus pRK600 Übertragung, werden alle Plasmide zufällig von Zelle zu Zelle übertragen. Diese Übertragung führt zur Erstellung von trans-Integranten in der Mischung, durch die LP-Belastung der Übernahme der beiden Plasmide für IMCE, die Integrase (int) Helferplasmid pJC2 und das Donorplasmid pJH110 erforderlich. Der Spender Kassette aus dem nicht-replizierenden Donorplasmid (pJH110) über ΦC31 Integrase-Aktivität mit den Markern der LP-Kassette auf dem Chromosom ausgetauscht, was zu einem Verlust der LP-Marker (Spr und uidA) und die Aufrechterhaltung des Spenders Kassette (RFP und Gm r) in der resultierenden trans-Integranten.
Abbildung 2. A:. Mating Spot Platte auf einem nicht-selektiven TY Schild mit getrockneten Zell-Mischungen auf der Agar-Oberfläche B: Mating Flecken auf Streptomycin-Gentamicin-X-Gluc Platte ausgestrichen, von links oben keine Integrase-Regler im Uhrzeigersinn, IMCE in S. meliloti, E. coli DH5 mit pJC2 Kontrolle, E. coli DH5a mit pJH110 Kontrolle, E. coli MT616 Kontrolle, und S. . meliloti UW227 Kontrolle C: 10 -2 Verdünnung der Paarung Spot Resuspension auf TY Streptomycin-X-Gluc Agar D:. 10 -2 Verdünnung der Paarung Spot Resuspension auf TY-Streptomycin Gentamicin-X-Gluc-Agar (blaue Kolonien sind einzelne Rekombinanten, weiße Kolonien unterzogen wurden wahr. Kassettenaustausch) E: 10 -2 Verdünnung der Paarung Spot Resuspension auf TY Streptomycin-X-Gluc-Agar zeigt fehlende Fluoreszenz F:. 10 -2 Verdünnung der Paarung Spot Resuspension auf TY-Streptomycin Gentamicin-X-Gluc-Agar zeigt zwei Ebenen der Fluoreszenz (heller Kolonien, blaue Kolonien entsprechen und eine höhere Expression rfp vermutlich auf Lese-Promotor wenn von Vektorsequenz, wo Kolonien viele Veränderungen und-Kassettenaustausch enthalten RFP mit nur seinen unmittelbaren Promotor ohne Durchlese vom lac-Promotor in mit der Vektor ist die nicht vorhanden.).
Die IMCE Technik ermöglicht die effiziente Integration von einem einzigen attB flankiert DNA-Kassette in die LP-Locus eines zuvor entwickelten Stamm. Sobald das gewünschte Konstrukt anstelle der RFP, den Spender Kassette erstellen geklont wird, kommt die Technik nicht erforderlich, anschließende DNA-Reinigung und Transformation, so dass es sehr robust. Es ist wichtig, dass geeignete Wachstumsbedingungen Steuerelemente enthalten sind, sicher zu sein, die Resistenz gegen Antibiotika aufgrund der Erzeu...
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Um Margaret CM Smith für die freundliche Bereitstellung des Integrase-Klon
Drittmittelförderung von:
Genome Kanada / Genome Prairie
NSERC Discovery and Strategic Project Zuschüsse
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
Streptomycin | Bioshop Kanada Inc. | STP101 | |
Spectinomycin | Bioshop Kanada Inc. | SPE201 | |
Gentamicin | Bioshop Kanada Inc. | GTA202 | |
Chloramphenicol | Bioshop Kanada Inc. | CLR201 | |
Tetracycline | Bioshop Kanada Inc. | TET701 | |
Kanamycin | Bioshop Kanada Inc. | KAN201 | |
Bakteriologische Qualität Agar | Bioshop Kanada Inc. | AGR001 | |
Trypton | Bioshop Kanada Inc. | TRP402 | |
Hefeextrakt | Bioshop Kanada Inc. | YEX401 | |
Kochsalz | Bioshop Kanada Inc. | SOD001 | |
Kalziumchlorid | Bioshop Kanada Inc. | CCL444 | |
X-gluc | Gold-Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
E. coli-Stamm MT616 | Auf Anfrage erhältlich | Auch außerhalb unseres Labors verwendet | |
E. coli-Stamm pJC2 | Im Haus, auf Anfrage erhältlich | ||
E. coli-Stamm pJH110 | Im Haus, verfügbar durch request | ||
SmUW227 Belastung | Im Haus, auf Anfrage erhältlich |
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