Tomografia Computadorizada guiada por tomografia difusa no domínio do tempo de fluorescência em pequenos animais para localização de biomarcadores de câncer

Resumo

Tomografia de fluorescência difusa oferece uma abordagem de custo relativamente baixo e com elevado potencial de todo a pré-clínica In vivo Imagem do tumor. A metodologia de coleta de dados ópticos, calibração e reconstrução da imagem é apresentada para uma tomografia computadorizada guiada sem contato do sistema no domínio do tempo usando fluorescente direcionamento do tumor receptor do fator de crescimento epidérmico biomarcador em um modelo de glioma mouse.

Resumo

Pequenos animais de fluorescência molecular imaging (FMI) pode ser uma poderosa ferramenta para a descoberta da droga pré-clínicos e estudos de desenvolvimento ^1. No entanto, a absorção de luz por cromóforos de tecidos (por exemplo, a hemoglobina, água, lípidos, a melanina) tipicamente limita propagação do sinal óptico por meio de espessuras maiores do que alguns milímetros ^2. Comparado a outros comprimentos de onda visíveis, absorção de tecido para o vermelho e infravermelho próximo (near-IR) de absorção de luz diminui drasticamente e não-elástica dispersão torna-se o mecanismo de interação dominante luz-tecido. O desenvolvimento relativamente recente de agentes fluorescentes que absorvem e emitem luz na gama de quase-IR (600-1000 nm), tem conduzido ao desenvolvimento de sistemas de imagem e modelos propagação da luz que podem alcançar corpo inteiro tridimensional de imagem em pequenos animais ^3.

Apesar de grandes avanços nesta área, a natureza mal-colocados da tomografia de fluorescência difusa permanece um significativoproblema para a estabilidade, a recuperação de contraste e resolução espacial de técnicas de imagem e de reconstrução a melhor abordagem para o FMI em pequenos animais ainda não foi acordado. A maioria dos grupos de pesquisa têm investido em charge-coupled device (CCD) baseados em sistemas que fornecem sensibilidade dos tecidos de amostragem, mas suboptimal abundantes ^4-9, enquanto o nosso grupo e alguns outros ^10-13 têm buscado sistemas baseados em detectores de alta sensibilidade , que neste momento permitir amostragem de tecido denso para ser conseguida somente à custa da taxa de transferência de imagem baixa. Aqui nós demonstrar a metodologia de aplicação de um único fóton tecnologia de detecção em um sistema de tomografia de fluorescência para localizar uma lesão cerebral canceroso em um modelo de mouse.

A fluorescência tomografia do sistema (FT) empregados único fóton contando com tubos fotomultiplicadores (PMT) e rico em informações de detecção de luz no domínio do tempo em uma conformação de não-contato ^11. Isto proporciona uma col simultânealição de excitação e emissão de luz transmitida, e inclui o controle de exposição automática de fluorescência de excitação ^14, referência laser, e co-registro com um animal de pequeno tomografia computadorizada do sistema (microCT) ^15. Um modelo de rato nu foi usado para geração de imagens. O animal foi inoculado ortotopicamente com uma linha de células de glioma humano (U251), no hemisfério cerebral esquerdo e fotografada 2 semanas mais tarde. O tumor foi feita a fluorescência por injecção de um traçador fluorescente, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) dirigidas para o receptor de factor de crescimento epidérmico, uma proteína da membrana celular conhecido por ser superexpresso na linha de tumor U251 e muitos outros cancros ^18. Um segundo, untargeted traçador fluorescente, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) foi também injectado para explicar os efeitos de receptores não-mediadas na absorção dos marcadores orientadas para fornecer um meio de quantificar ligação do marcador, receptor de disponibilidade / densidade ^27. A CT-guiada, time-domínio algoritmo foi usado para reconstruir o local de ambos marcadores fluorescentes (isto é, a localização do tumor) no cérebro do rato e da sua capacidade para localizar o tumor foi verificada por meio de contraste de imagem por ressonância magnética.

Embora demonstrada para imagens de fluorescência em um modelo de rato glioma, a metodologia apresentada neste vídeo pode ser estendido para diferentes modelos de tumores em vários modelos animais pequenos potencialmente até o tamanho de um rato ^17.

Protocolo

1. Preparação dos animais

1. Anestesiar rato nu (Charles River, Wilmington, MA) com injecção intra-peritoneal de cetamina-xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg ip).
2. Coloque o rato na moldura estereotáxica, fazer uma incisão no couro cabeludo do lado esquerdo do crânio e, usando uma agulha de 18 gauge, criar um orifício de 1 mm de diâmetro no crânio milímetros 2 a partir da linha central e 2 mm atrás do bregma.
3. Injectar 5 × 10 ⁵ U251 humanas células de glioblastoma neuronais (gentilmente fornecida pelo Dr. Mark Israel no Dartmouth College, Hanover, NH) em 5 ml de solução tampão de fosfato para o hemisfério cerebral esquerdo, a uma profundidade de aproximadamente 2 mm abaixo da superfície do cérebro. Usar uma micro-seringa Hamilton ¹⁸ e um romba terminou calibre 27 com agulha para o implante de células e inserir a ponta da agulha 3 milímetros a partir da superfície externa do crânio e depois retirar 1 mm a criar uma bolsa para as células.
4. Local da sutura da incisão e permitir reperação de uma cirurgia.
5. Espere ~ 14 dias para permitir que o tumor crescer antes de imagem.

2. A calibração do sistema de fluorescência Tomografia

1. No dia da imagem do rato, iniciar sistema e permitir que os lasers e detectores de luz para aquecer-se durante aproximadamente 20 minutos para evitar desvios em relação à sensibilidade do sistema.
2. Coloque um 100 °-por-4 ° engenharia linha difusor (Thorlabs, Newton, NJ) no centro directa do pórtico de imagem, o normal para o laser de excitação: um picossegundo-80-pulsado MHz diodo laser multimodo 635 nm (PicoQuant Photonics Norte America Inc., Westfield, MA). Ajustar o ângulo do difusor para maximizar a quantidade de sinal detectado por todos os cinco canais de recolha de luz. Uma descrição completa da geometria de imagem é fornecida em outro ^11,14,15.
3. Coloque OD 2 filtros de densidade neutra (Thorlabs, Newton, NJ) na frente de todos os tubos de detecção de fluorescência fotomultiplicador (PMT) e 1 OD filtros de densidade neutra (Thorlabs, Newton, NJ) na frente de todos os PMTs detecção de transmitância. Colete 100 perfis de pulsos temporais de dispersão (TPSF) do laser, cada um com um tempo de integração 1-s.
4. Normalize cada TPSF pela referência laser, correto o desvio temporal na referência laser, e média de todas as iterações para cada detector. Estes são os médios TPSFs detector funções específicas do instrumento de resposta (IRF) utilizados na reconstrução da imagem óptica.

3. Imagem Protocolo

1. Anestesiar o rato com 2% de isoflurano em oxigénio (1 L / min).
2. Injectar 1 nanomole de IRDye 800CW-EGF e 1 nanomole de Alexa Fluor 647 em 100 uL de solução de tampão fosfato, por via intraperitoneal, 12 h antes da imagem para alvejar de crescimento epidérmico superexpressão do receptor do factor no tumor.
3. Posicione o mouse sobre a fibra de vidro suporta o leito de imagem, organizando o mouse de modo que seu nariz permanece em um cone entregar anestesia com isoflurano.
4. Encerteza de que o rato é posicionado de forma adequada sobre a cama: isto é, que, quando o leito é presa no sistema de tomografia de fluorescência com o rato está no centro aproximado do pórtico de imagem. Este posicionamento pode ser guiado pela rotação do excitação laser 180 ° em torno do rato, assegurando que o ponto focal do laser ilumina um ponto aproximadamente no centro do rato a partir da perspectiva do laser em todos os ângulos.
5. Uma vez posicionado, transferir cuidadosamente a cama de imagem e mouse para o microCT (explorar Locus, a GE Healthcare, London, ON) scanner e coletar informações anatômicas com uma resolução de 93 mícrons isotrópico para toda a cabeça do rato.
6. Visualizar a pilha de imagem TC e escolher a fatia (s) a ser trabalhada com o sistema de tomografia de fluorescência.
7. Transferir cuidadosamente a cama de imagem e mouse de volta para o sistema de tomografia de fluorescência. Escolha o número de posições de origem para coletar dados sobre o mouse para cada slic imageme (32), o tempo de integração para cada medição TPSF (1 s), o número de iterações para cada posição da fonte (10), ea posição e número de fatias de imagem desejados a partir da pilha de imagem TC a partir do Passo 3,6. Os números entre parênteses são valores típicos para cada parâmetro de imagem rendendo aproximadamente 5 minutos de aquisição de dados por fatia de imagem.
8. Coloque filtros notch triplos (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) na frente dos PMTs detecção por fluorescência, para restringir qualquer luz laser de atingir os detectores de fluorescência, e OD 2 filtros de densidade neutra diante dos PMTs detecção de transmitância para evitar a saturação dessas detectores.
9. Executar o software de aquisição de dados, na recolha de fluorescência e de transmitância TPSFs em cada posição definida a fonte eo detector e para cada comprimento de onda de excitação (635 nm e 755 nm para excitar a Alexa Fluor 647 e IRDye 800CW-EGF marcadores, respectivamente). Para cada conjunto de TPSFs coletados, monitorar e registrar a intensidade do lasercom um canal de PMT de referência.

4. Reconstrução da imagem

1. Determinar a superfície exterior do rato e da localização das hastes de suporte de imagem de leito a partir das imagens de TC e criar máscaras, que abrange os limites do rato e as hastes de imagem separadamente.
2. Use a máscara do rato para produzir uma malha de elementos finitos do animal utilizando o software NIRFAST ^19.
3. Localizar as posições de origem e de detector a partir do sistema de tomografia de fluorescência na superfície da malha com base em microCT e registo espacial fluorescência coordenadas ^20.
4. Remover pontos ópticos de dados associados com origem ou detector de posições que interagem com a localização das hastes de suporte de imagem de cama.
5. Normalizar os dados coletados em cada posição detector fonte pela referência a laser, corrigir o desvio temporal na referência laser, e correta para as sensibilidades do filtro, que foram determinadas pelo teste experimental no momento da compra ^15.
6. Tomar a Razão de Nascido dos dados (fluorescência dividida pela transmitância) para cada posição de fonte eo detector e multiplicam-se com uma simulação do modelo para a frente de transmitância com base na malha de animais de elementos finitos para uniformes propriedades ópticas. Isto é feito para minimizar os erros associados com a fonte ou detector de tecido de acoplamento ^21, para calibrar os dados para o modelo ^22, e para ajustar os dados para os outros aspectos da modelo de dados-incompatibilidade ^23,24.
7. Construir um vector de dados composto da diferença em escala dos dados de taxa nascidos recolhidos em ambos os comprimentos de onda. O fator de escala é escolhido para maximizar EGFR contraste vinculativo. Execute no domínio do tempo de reconstrução de imagem com os dados diferença calibrados usando o TPSF para cada canal de detecção como uma entrada, e criar mapas de fluorescência do marcador com contraste alvo ^15.

5. Os resultados representativos

"> Um exemplo de uma reconstrução de fluorescência revestida com uma imagem anatómica co-CT registada a partir da cabeça de um rato com um tumor U251 glioma ortotópico é apresentado na Figura 1b. O centro de massa do glioma determinada pela reconstrução fluorescente (Figura 1b ) foi de 1 mm do centro de massa do tumor determinada por contraste de melhorar a ressonância magnética (Figura 1a). As imagens de TC e RM foram co-registados com base em uma transformação informação mútua.

Figura 1. Com contraste (gadolínio) ressonância magnética de cabeça de rato (a). O rato foi inoculado ortotopicamente com uma linha de células de glioma humano U251. A localização do tumor, o qual absorve mais agente de contraste do que o cérebro normal, pode ser visto no hemisfério cerebral esquerdo (à direita na imagem) e indicada pela seta branca. O corresponding computadorizada da imagem tomografia (a partir do mesmo local na cabeça de rato) é descrito em (b) com o factor de crescimento epidérmico alvo fluorescência menos o sobreposto reconstrução untargeted fluorescência. As unidades de fluorescência em mm inversa e se relacionam com o coeficiente de absorção da fluorescência específica ligada multiplicada por sua eficiência quântica e por sua concentração.

Discussão

Fluorescência tomografia (FT) é um sensível, radiação ionizante modalidade de imagem molecular com base na livre visível e do infravermelho próximo de transportes luz através do tecido biológico. A maior parte do interesse na FT tem sido focada em seu potencial para acelerar a descoberta e desenvolvimento de medicamentos em animais de pequeno porte modelos experimentais ¹ e uma área-chave da investigação foi o estudo da expressão de biomarcador do cancro e de resposta às terapias moleculares ^26. Atualmente, existem duas abordagens concorrentes para FT projeto do sistema. O desenho mais comum é baseada em refrigeração charge-coupled device (CCD) câmeras para detecção de fluorescência ^4-9. Esta concepção proporciona uma elevada densidade de medições, a maximização de amostragem de tecido uma vez que cada pixel na câmara CCD pode detectar a luz que tenha percorrido um caminho único através do tecido. No entanto, as câmaras CCD têm um alcance limitado dinâmico, leia-o ruído limita sua sensibilidade final. O segundo projeto evita a limitação potencial ções de CCD detecção câmara, empregando a tecnologia de contagem altamente sensível único-fotão baseada na utilização de detectores, tais como tubos fotomultiplicadores ou fotodíodos avalanche ^10-13. A desvantagem destes métodos de detecção mais sensível é que cada detector só pode recolher luz num único ponto, por isso, a obter uma amostragem de tecido denso, quer detectores muitos têm de ser utilizado (o que é muito caro), ou projecções muitos têm de ser trabalhada com o mesmo detector (que pode ser demorado). Enquanto o nível ótimo de amostras de tecido para FT pequeno animal não tiver sido acordado, e podem variar em uma base caso a caso, concorda-se que um único fóton instrumentação contagem é mais adequada para explorar os limites de sensibilidade de FT em termos da sua capacidade para detectar baixas concentrações de marcadores moleculares. Neste estudo, nós fornecemos uma metodologia para a realização de FT em um único fóton instrumentação de detecção contagem para localizar tumores em camundongos.

ent "> Existem quatro passos críticos envolvidos para produzir conjuntos de dados robustos com o tempo correlacionados FT-fotão único de contagem. O primeiro é a aplicação de um procedimento de calibração apropriada e fácil. Na metodologia apresentada, as sensibilidades respectivas de cada canal de detecção são contabilizados para através da recolha de uma medição de referência de luz de excitação transmitida através de uma linha de difusor concebido para dirigir fracções iguais de luz para cada detector ^15. Além disso, a luz detectada durante uma experiência é continuamente calibrado para a referência de laser, tanto em termos de intensidade e significa . tempo, o que poderia variar ao longo do tempo, pela operação de um laser de referência canal ^11,15 O segundo passo crítico é a recolha precisas e co-registo de imagem anatómica para guiadas reconstruções de fluorescência Os dados FT sozinho não oferece qualquer informação anatómica.; por conseguinte, a fim de criar um modelo de transporte de luz que pode ser usado para reconstruir o LOcatião de fontes fluorescentes dentro de um espécime da fluorescência detectada na superfície do espécime, a anatomia do espécime em relação ao sistema de FT deve ser conhecida com precisão. No nosso sistema, a informação anatómica é adquirida por um sistema de tomografia computadorizada com micro-coordenadas espaciais que foram registados espacialmente com as do sistema de FT ^15,20. O terceiro passo crítico envolve garantir que uma exposição óptima (isto é, o tempo total de detecção de fotões para cada projecção laser) é empregada em cada posição fonte eo detector. Isto é importante, por duas razões: em primeiro lugar, para assegurar que não é adequada sinal-ruído em cada posição de detecção e segundo para evitar a saturação do detector, o que poderia danificar as unidades de detecção. A fim de alcançar uma exposição óptima em cada posição do detector, um controle automático de exposição é empregue, o qual essencialmente triangula a exposição óptima a partir de dois, de baixo do sinal ¹⁴ exposições. A crítica quartopasso da metodologia está a fazer referência os dados recolhidos de fluorescência para a quantidade de luz de excitação transmitido. Esta referência é muitas vezes chamada de taxa de Born, e proporciona muitos benefícios para FT, com o principal sendo uma atenuação de erros do modelo de dados-incompatibilidade ^23,24. O sistema apresentado foi concebido para detectar a luz de excitação de fluorescência e ambos transmitidos simultaneamente por canalizando a luz em cada canal de detecção em 2 tubos fotomultiplicadores separados. Ao fazer isso, nós evitamos os efeitos do movimento sobre a veracidade da relação de Born.

Com um conjunto de dados robusto que lado, a reconstrução da imagem de tempo de domínio de dados envolve a solução do problema inverso da malha de elementos finitos com a expressão:

d = Jx

onde d é um vetor com n elementos x m para n fonte de detectores de projeções e TPSF m tempo portões; J é um n x m-por-sensibilidade l de matriz (ou Jacobiana), para os nós de l na malha; e X é o vector de fluorescência propriedades ópticas em cada nó, tendo l tamanho d são os dados recolhidos calibradas durante a experiência e J é simulado utilizando a solução de elemento finito. para a aproximação de difusão no domínio do tempo de fluorescência de transporte ^25. O tempo de dimensão de J é também convolved com as funções de detecção de resposta específicos do instrumento. X é uma representação do mapa de fluorescência de interesse e é resolvido pela utilização de um Levenberg-Marqardt pelo menos não-negativo abordagem quadrados com Tikhonov regularização ^15.

A metodologia apresentada aqui, que descreve um procedimento capaz de localizar tumores fluorescente etiquetado em camundongos usando altamente sensíveis fóton contagem detecção por fluorescência, tem o potencial de ampliar os limites da FT. Num estudo anterior, o potencial de empregar esteabordagem em maior-que-ratos modelos animais, como ratos, bem como uma maior sensibilidade sobre projetos de sistemas existentes no rato do tamanho de amostras, foi demonstrado ^17. A aplicação imediata dessa abordagem seria para o monitoramento de expressão de biomarcadores in vivo em modelos de tumores pequenos animais para avaliar a eficácia de drogas em um meio de alto rendimento. A capacidade do sistema para excitar e detectar a fluorescência em comprimentos de onda múltiplos permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores fluorescentes. Adicionais marcadores fluorescentes fornecer um meio de interrogar múltiplos aspectos de uma patologia, simultaneamente, ou poderia ser utilizado, como no presente estudo, a empregar abordagens de imagem mais quantitativos, tais como repórter duplo métodos de medição do potencial de ligação in vivo, um marcador da densidade do receptor ^26,27.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidil éster	Life Technologies	A20106	Reagido com água para minimizar a ligação não-específica