Компьютерная томография наведением во временной области диффузного флуоресцентная томография у мелких животных для локализации рака биомаркеров

Резюме

Диффузный флуоресценции томография предлагает относительно недорогое и потенциально высокой всей подход к доклинической В естественных условиях Опухоль изображений. Методология оптических сбора данных, калибровки и реконструкции изображений представлена ​​на компьютерной томографии наведением бесконтактного времени в системе доменных имен с использованием флуоресцентной ориентации опухоли биомаркеров рецептор эпидермального фактора роста в модели глиомы мышей.

Аннотация

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies¹. However, light absorption by tissue chromophores (e.g., hemoglobin, water, lipids, melanin) typically limits optical signal propagation through thicknesses larger than a few millimeters². Compared to other visible wavelengths, tissue absorption for red and near-infrared (near-IR) light absorption dramatically decreases and non-elastic scattering becomes the dominant light-tissue interaction mechanism. The relatively recent development of fluorescent agents that absorb and emit light in the near-IR range (600-1000 nm), has driven the development of imaging systems and light propagation models that can achieve whole body three-dimensional imaging in small animals³.

Despite great strides in this area, the ill-posed nature of diffuse fluorescence tomography remains a significant problem for the stability, contrast recovery and spatial resolution of image reconstruction techniques and the optimal approach to FMI in small animals has yet to be agreed on. The majority of research groups have invested in charge-coupled device (CCD)-based systems that provide abundant tissue-sampling but suboptimal sensitivity^4-9, while our group and a few others^10-13 have pursued systems based on very high sensitivity detectors, that at this time allow dense tissue sampling to be achieved only at the cost of low imaging throughput. Here we demonstrate the methodology for applying single-photon detection technology in a fluorescence tomography system to localize a cancerous brain lesion in a mouse model.

The fluorescence tomography (FT) system employed single photon counting using photomultiplier tubes (PMT) and information-rich time-domain light detection in a non-contact conformation¹¹. This provides a simultaneous collection of transmitted excitation and emission light, and includes automatic fluorescence excitation exposure control¹⁴, laser referencing, and co-registration with a small animal computed tomography (microCT) system¹⁵. A nude mouse model was used for imaging. The animal was inoculated orthotopically with a human glioma cell line (U251) in the left cerebral hemisphere and imaged 2 weeks later. The tumor was made to fluoresce by injecting a fluorescent tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) targeted to epidermal growth factor receptor, a cell membrane protein known to be overexpressed in the U251 tumor line and many other cancers¹⁸. A second, untargeted fluorescent tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) was also injected to account for non-receptor mediated effects on the uptake of the targeted tracers to provide a means of quantifying tracer binding and receptor availability/density²⁷. A CT-guided, time-domain algorithm was used to reconstruct the location of both fluorescent tracers (i.e., the location of the tumor) in the mouse brain and their ability to localize the tumor was verified by contrast-enhanced magnetic resonance imaging.

Though demonstrated for fluorescence imaging in a glioma mouse model, the methodology presented in this video can be extended to different tumor models in various small animal models potentially up to the size of a rat¹⁷.

протокол

1. Подготовка животных

1. Обезболить голых мышей (Charles River, Уилмингтон, Массачусетс) с внутри-перитонеального инъекции кетамина-ксилазина (100 мг / кг: 10 мг / кг).
2. Место мыши в стереотаксической рамки, сделать надрез на коже головы с левой стороны черепа и, используя 18-иглы, создать 1 мм, диаметр отверстия в черепе 2 мм от центральной линии и 2 мм сзади брегмы.
3. Вводите ⁵ × 10 5 U251 человека нервных клеток глиобластомы (любезно предоставлена ​​д-р Марк Израиль в Dartmouth College, Hanover, NH) в 5 мкл фосфатного буферного раствора в левом полушарии мозга на глубине около 2 мм ниже поверхности мозга. Использование микро-Гамильтона шприц ¹⁸ и тупыми концами 27-иглы для сотовых имплантации и вставьте кончик иглы 3 мм от наружной поверхности черепа, а затем снять 1 мм для создания кармана для клеток.
4. Шовный сайт разрез и позволяет повторнооткрытию после операции.
5. Подождите около 14 дней, чтобы опухоль расти до визуализации.

2. Флуоресценция системы томографии калибровки

1. В день изображение мыши, начать систему и лазеров и приемников света для разминки в течение примерно 20 минут, чтобы избежать дрейфует в чувствительности системы.
2. Положите 100 ° на 4 ° модифицированная линия диффузор (Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) в прямом центре изображения козловые, нормально к лазерного возбуждения: пикосекундных импульсных 80-МГц многомодового 635 нм лазерный диод (PicoQuant Photonics Северной Америка инк, Westfield, MA). Регулировка угла диффузора максимально количество сигнал обнаружить все пять каналов сбора света. Полное описание геометрии изображения осуществляется в другом месте ^11,14,15.
3. Поместите OD 2 фильтры нейтральной плотности (Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) на глазах у всех флуоресценции обнаружения фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) и OD 1 фильтры нейтральной плотности (Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) на глазах у всех ФЭУ пропускания обнаружения. Собрать 100 временных импульс распространению профилей (TPSF) лазера, каждый с 1-е время интеграции.
4. Нормализовать каждый TPSF лазером ссылка, для правильной временной дрейф в лазерной ссылки, и усреднение по всем итераций для каждого детектора. Эти усредненные TPSFs являются детектор конкретным инструментом функций отклика (IRF), используемых в оптической реконструкции изображения.

3. Протокол изображений

1. Обезболить мышь с 2% ИФ кислорода (1 л / мин).
2. Вводите 1 наномоля из IRDye 800CW-EGF и 1 наномоля от Alexa Fluor 647 в 100 мкл фосфатного буферного раствора, внутрибрюшинно, 12 ч до изображения целевой рецептора эпидермального фактора роста гиперэкспрессия в опухоли.
3. Наведите на стекловолокно носители изображения кровать, устраивая мыши так, чтобы его нос остается в конусе доставки ИФ анестезии.
4. EnУбедитесь, что мышь находится соответственно на кровать: например, что когда кровать надежно закреплены в флуоресценции системы томографии мышь в приблизительно в центре изображение портала. Такое расположение может руководствоваться вращения лазерного возбуждения 180 ° вокруг мыши, гарантируя, что центром лазерной освещает точку примерно по центру мыши с точки зрения лазера на всех углах.
5. Как только положение, тщательно передать кровать изображений и мыши microCT (изучение локуса, GE Healthcare, Лондон, ON) сканером и собирать анатомической информации с разрешением 93 мкм изотропной для всей голове мыши.
6. Визуализируйте стек КТ изображение и выберите кусок (ы) для включения в образ с флуоресценции системы томографии.
7. Тщательно передачи изображений кровать и мышь к флуоресценции системы томографии. Выберите количество исходных позиций для сбора данных о мыши для каждого изображения SLICе (32), время интегрирования для каждого TPSF измерения (1 с), число итераций для каждого исходного положения (10), положение и количество желаемых кусочки изображения из стека КТ изображений, начиная с шага 3.6. Цифры в скобках указаны типичные значения для каждого параметра изображения приносит ~ 5 минут на сбор данных кусочек изображения.
8. Установите тройной фильтр метка (Chroma технологий корпорации, сильфонные Falls, VT) перед флуоресценции ФЭУ обнаружения, чтобы ограничить любое лазерное излучение от достижения флуоресценции детекторами, и OD 2 нейтральные фильтры перед ФЭУ пропускания обнаружения, чтобы избежать насыщения из этих детекторов.
9. Запустите программу сбора данных, сбора флуоресценции и прозрачность TPSFs на каждом определенном положении детектора источник и для каждой длины волны возбуждения (635 нм и 755 нм для возбуждения Alexa Fluor 647 и IRDye 800CW-EGF индикаторов, соответственно). Для каждого набора TPSFs мусора, контроля и регистрации интенсивности лазерного излученияс каналом PMT ссылки.

4. Восстановление изображений

1. Определение внешней поверхности мыши и расположение изображений стержней кровать поддержку со стороны КТ и создает маски, которая охватывает пределы мыши и изображения стержней отдельно.
2. Используйте мышь, маски для создания конечно-элементной сетки животных с помощью программного обеспечения NIRFAST ^19.
3. Локализация источника и детектора позиции по флуоресценции системы томографии на поверхности сетки на основе microCT и флуоресцентной регистрации пространственных координат ^20.
4. Удалить оптических точек данных, связанных с источником или детектора позиции, которые взаимодействуют с расположением изображения стержней кровать поддержки.
5. Нормализация данных, собранных в каждом положении детектора источника лазерного ссылки, правильно для временного дрейфа лазерного ведения и правильный фильтр для чувствительности, которые были определены экспериментальная проверка на момент покупки ^15.
6. Возьмите Родился Соотношение данных (флуоресценция разделены пропускания) для каждого источника извещателя и размножаются с передним имитационной модели пропускания на основе конечно-элементной сетки для животных однородными оптическими свойствами. Это делается, чтобы смягчить ошибки, связанные с источником или детектор тканей связи ²¹ для калибровки данных в модели ^22, а также корректировать данные для других аспектов модели данных несоответствие ^23,24.
7. Построить вектор данных состоит из масштабных отличие родился соотношение данных, собранных в обеих длин волн. Коэффициент масштабирования выбирается так, чтобы максимально EGFR обязательным контрастом. Выполните временной области реконструкции изображений с калиброванной разница данных с использованием TPSF для каждого канала обнаружения в качестве входных, а также создавать карты флуоресценции контрастным усилением целевых трассирующими ^15.

5. Представитель Результаты

"> Пример флуоресценции реконструкции обложил со-CT зарегистрированных анатомических изображений с головы мышь с U251 ортотопической опухоли глиомы представлена ​​на рисунке 1b. Центра масс глиомы определяется люминесцентные реконструкции (рис. 1b ) был в пределах 1 мм опухоли центра масс определяется контрастным повышения магнитно-резонансной томографии (рис. 1а). КТ и МРТ, также были зарегистрированы на основе взаимного преобразования информации.

Рисунок 1. Контрастным усилением (гадолиний) Магнитно-резонансное изображение мыши голову (а). Мыши инокулировали orthotopically с U251 линии человеческих клеток глиомы. Расположения опухоли, которая поглощает больше контраста, чем в нормальной ткани головного мозга, можно увидеть в левом полушарии мозга (справа на изображении), и указал на белую стрелку. Correspondinг компьютерная томография изображение (с того же места на голове мыши) изображена на (б) с эпидермального фактора роста целевых флуоресценции минус нецелевое флуоресценции накладной реконструкции. Единиц флуоресценции находятся в обратной мм и относятся к коэффициенту поглощения связанного целевого флуоресценции, умноженная на его квантовую эффективность и его концентрации.

Обсуждение

Флуоресценции томографии (FT) является чувствительным, ионизирующее излучение свободного молекулярного метода визуализации основана на видимом и ближнем инфракрасном свете транспорта через биологические ткани. Основной интерес в FT была сосредоточена на его потенциал для ускорения открытия и разработки лекарственных средств в небольших животных экспериментальных моделей ¹ и одной из ключевых областей исследования стало изучение рака выражении биомаркеров и ответ на молекулярном терапии ^26. В настоящее время существует два конкурирующих подхода к проектированию системы FT. Наиболее распространенный дизайн основан на охлаждение прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры для обнаружения флуоресценции ^4-9. Такая конструкция обеспечивает высокую плотность измерений, максимальное отбор проб ткани, поскольку каждый пиксель в ПЗС-камеры можно обнаружить свет, который путешествовал уникальный путь через ткань. Однако, CCD камеры имеют ограниченный динамический диапазон и считывания шум ограничивает их предельной чувствительности. Вторая конструкция позволяет избежать потенциальных ограничений ных обнаружения ПЗС-камеры, используя высокочувствительный одного счета фотонов технология основана на использовании таких детекторов, как фотоэлектронных умножителей или лавинных фотодиодов ^10-13. Недостатком этих более чувствительных методов обнаружения, что каждый детектор может собирать свет в одной точке, поэтому для достижения плотной ткани выборки, либо много детекторов, которые будут использоваться (что очень дорого), либо многие прогнозы должны быть отображены с тем же детектором (которая может занять много времени). В то время как оптимальный уровень отбор проб ткани для малых FT животных не был согласован, и может варьироваться от случая к случаю, она решила, что одного счета фотонов приборы лучше подходит для изучения чувствительности пределы FT с точки зрения его способность обнаруживать низкие концентрации молекулярных маркеров. В этом исследовании, мы предоставляем методики для проведения FT использованием одного счета фотонов обнаружения приборов для локализации опухолей у мышей.

ENT "> Есть четыре важнейших шагов для получения надежных данных с корреляцией по времени одного счета фотонов FT. Первое применение подходящей и простой процедуры калибровки. В представленной методологии, соответствующей чувствительности каждого канала обнаружения, учитываются за счет сбора базовых измерений возбуждения света, прошедшего через линейный диффузор предназначен для направить равных долях света каждого детектора ^15. Кроме того, обнаружены свет во время эксперимента постоянно калибровать для лазерных ссылка, с точки зрения интенсивности и средней . времени, которая могла бы колебаться с течением времени, при эксплуатации лазерных опорного канала ^11,15 Второй важнейший шаг является точной сбора и совместного регистрации анатомических изображений для управляемых флуоресценции реконструкции FT данные только не дает анатомической информации. Таким образом, для того, чтобы создать модель легкого транспорта, которая может быть использована для восстановления воткатион люминесцентных источников в образце из обнаруженных флуоресценции на поверхности образца, анатомия образца по отношению к системе FT должны быть точно известны. В нашей системе, анатомические информация приобретает микро-компьютерная томография система с пространственным координатам, которые были зарегистрированы с пространственной организации системы FT ^15,20. Третий важный шаг включает в себя обеспечение оптимальной экспозиции (т. е. общий фотон время обнаружения для каждой лазерной проекции) работает в каждый источник-детектор позиции. Это важно по двум причинам: во-первых, обеспечить наличие адекватной сигнал-шум на каждом определения положения и второй детектор, чтобы избежать насыщения, которое может привести к повреждению блоков детектирования. В целях достижения оптимальной экспозиции в каждом детекторе позиции, автоматический контроль экспозиции используется, по существу триангулирует оптимальную экспозицию из двух, низкий сигнал воздействия ^14. Четвертый критическийшаг методологии ссылается на собранные данные флуоресценции на сумму проходящего света возбуждения. Это ссылки часто называют Родился соотношение, а также предоставляет много преимуществ для FT, основной из которых является смягчение модели данных ошибки рассогласования ^23,24. Представленная система была разработана, чтобы обнаружить и флуоресценции и передаваемых возбуждающего света одновременно, направляя свет в каждом канале регистрации на 2 отдельных фотоумножителей. Делая это, мы избегаем любых эффектов движения на точность Родился отношения.

С надежной данных ему руку, изображение реконструкции временной области данных включает в себя решения обратной задачи конечно-элементную сетку с выражением:

D = Jx

, где г-вектор с п х т элементов по п. источник-детектор прогнозы и м TPSF время ворота, J является п х м-на-л чувствительность матрицы (или якобианом), для л узлах сетки, а х-вектор флуоресценции оптические свойства в каждом узле, имеющий размер L D является калибровка данных, собранных в ходе эксперимента и J моделируется методом конечных элементов решения. для диффузии во временной области приближении флуоресценции транспорта ^25. Временном измерении J также свернут с детектором конкретных функций отклика прибора. Х является представление флуоресценции карта интересов и решается для использования Левенберга-Marqardt неотрицательные наименьших квадратов подход регуляризации Тихонова ^15.

Методология, представленная здесь, который описывает процедуру способны локализовать флуоресцентно меченных опухолей у мышей использованием высокочувствительных счета фотонов флуоресценции обнаружения, имеет потенциал, чтобы расширить границы FT. В предыдущем исследовании, потенциал использования этогоподход в большей, чем мыши животных моделях, таких как крысы, а также улучшенной чувствительностью по сравнению с существующими конструкции системы размером с мышь образцов, было продемонстрировано ^17. Непосредственное применение этого подхода будет для мониторинга биомаркеров выражение в естественных условиях в небольших моделях опухолей животных для оценки эффективности препарата в высокой пропускной способности средств. Способность системы для возбуждения и обнаружения флуоресценции на нескольких длинах волн позволяет одновременно регистрировать несколько флуоресцентных маркеров. Дополнительная флуоресцентные маркеры дают возможность допроса нескольких аспектов патологии, одновременно, или могут быть использованы, так как в этом исследовании, использовать количественные изображений подходы, такие как двойной репортер методы измерения в естественных условиях обязательного потенциал, маркер плотность рецепторов ^26,27.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (опционально)
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, сукцинимидил эфир	Life Technologies	A20106	Реагирует с водой, чтобы минимизировать неспецифического связывания