Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

Resumo

Zebrafish representam um modelo de vertebrados poderosa que tem sido sub-utilizado para estudos metabólicos. Aqui descrevemos uma forma rápida para medir a In vivo Perfil metabólico de zebrafish desenvolvimento que permite a comparação dos diferentes parâmetros da função mitocondrial entre geneticamente ou farmacologicamente embriões manipulados, aumentando assim a aplicabilidade deste organismo.

Resumo

A meta de crescimento no campo do metabolismo é determinar o impacto da genética em diferentes aspectos da função mitocondrial. Compreender essas relações vão ajudar a entender a etiologia subjacente para uma série de doenças relacionadas à disfunção mitocondrial, como diabetes e obesidade. Os recentes avanços na instrumentação, tem permitido o monitoramento de parâmetros distintos de função mitocondrial em linhas de células ou explantes de tecido. Aqui apresentamos um método para uma análise rápida e sensível de parâmetros da função mitocondrial in vivo durante o desenvolvimento embrionário zebrafish utilizando o cavalo marinho de biociências XF 24 analisador de fluxo extracelular. Este protocolo utiliza o Captura Islet microplacas onde um único embrião é colocado em cada cavidade, o que permite a medição da bioenergética, incluindo: (i) a respiração basal, (ii) da respiração mitocondrial respiração basal (iii) mitocondrial devido à rotação de ATP, (iv) mitocondrial respiração desacoplado ou prOton vazamento e (iv) a respiração máxima. Utilizando esta abordagem parâmetros da respiração zebrafish embrionárias podem ser comparadas entre o tipo selvagem e os embriões geneticamente alteradas (mutante, a sobre-expressão do gene ou gene knockdown) ou aqueles manipulado farmacologicamente. Prevê-se que a disseminação de este protocolo irá proporcionar aos investigadores novas ferramentas para analisar a base genética de doenças metabólicas in vivo neste modelo relevante vertebrado animal.

Protocolo

Parte 1: Tratamento Químico de Embriões Zebrafish

1. Coletar embriões zebrafish após a fertilização. Incubar a 28,5 ° C em meio de Nota E3 em 100 x 15 milímetros pratos de Petri:. Para a hibridização in situ ou óleo-Red-O coloração, 1-fenil-2-tioureia (PTU) a uma concentração final de 0,2 mM é adicionado a inibir a formação de pigmentos, ^1, mas não é necessário para a análise Seahorse.
2. Para os estudos farmacológicos, adicione a química requerida para uma concentração final adequada para o desenvolvimento de embriões de peixes-zebra a cerca de 26 hr pós-fertilização (hpf), com uma nota de veículo somente para o controlo adequado:. Sensíveis à luz, para inibidores farmacológicos, os embriões podem ser autorizados a desenvolver em o prévio escuro para análise.

Parte 2: Perfil Metabólico ao vivo usando o cavalo marinho XF 24 Analyser

1. Antes de cada corrida, o cavalo marinho XF cartucho Analyser 24 que abriga o ₂ O e H + fluoróforos é calibrado por meio de um processo automatizado realizada pelo analisador.
2. Preparação da placa de 24 poços de ilhotas XF 24. A seguinte seqüência experimental é empregado:
   1. Uma vez que o consumo de oxigénio é sensível a variações de temperatura, quatro poços são usadas para controlar as flutuações de temperatura possíveis através da placa. Estes poços não contêm embriões, mas são preenchidos com 700 ul de meio E3 (Figura 2A).
   2. Os restantes 20 poços (ver parte 2.2) são preenchidos com 700 ul de meio E3 e um embrião cada (Figura 2B).
   3. Para cada experiência, 10 embriões foram tratados com o veículo apenas (controlo) e 10 tratados com o inibidor químico (tratado). Embriões de controlo e tratado são alternados (por exemplo, bem A2: embrião de controlo; bem A3: embriões tratados com: A4 bem: embrião de controlo; embrião A5 assim tratado, etc.)
   4. Uma captura de tela ilhota é adicionado no topo da. cada poço para assegurar que a amostra se mantenha na câmara de medição em todo o ensaio (Figura 2B) Nota: tratados quimicamente embriões permanecem com a solução química original durante todo o processo, sem a necessidade de lavar o produto químico, antes de executar o analisador Seahorse programa.
   5. Uma vez terminado, a placa é carregada no Analyser Seahorse e o ensaio é iniciado.
3. A análise de amostras. Dois ensaios diferentes são rotineiramente realizados.
   1. Programa de respiração basal respiração / Máximo (duração de aprox. 90 min). Alterações na respiração basal subjacente disfunção metabólica, enquanto que a respiração máxima é uma medida da capacidade total de produção de energia e as alterações neste parâmetro associado com um número de estados patológicos e fisiológicos tanto. A capacidade respiratória de reserva, ou a capacidade para o sistema para aumentar a produção de ATP, é também calculadaa partir deste teste pela subtração dos basal de respiração máxima. Três repetições de cada mistura (2 min) / espera (1 min) / medição (2 min) ciclo é realizado para estabelecer primeiro respiração basal. No final do terceiro ciclo, a uma concentração final de 2,5 uM de FCCP (mitocondrial protonophore / desacoplador) é adicionado a cada poço permitindo a medição da respiração máxima. O ciclo de medição é então repetido 5-8 vezes (Figura 3).
   2. ATP programa vazamento de volume de negócios / Proton (duração aprox. Min 60). Respiração devido ao volume de negócios ATP representa a principal função da mitocôndria na forma de produção de ATP, enquanto a respiração devido a vazamento de prótons, ou respiração desacoplado, está intimamente ligado com outros parâmetros da função mitocondrial, incluindo respiração basal e formação de espécies reativas de oxigênio. Respiração devido à rotação de ATP é representada pela diferença de respiração após a adição de 25 uM oligomicina (um inibidor do ATP-sintase), em comparação com a respiração basal. Respiração desacoplado, ou respiração devido a fugas de protões, é determinada através do cálculo da diferença entre a oligomicina mediada respiração e respiração após a adição de 25 uM rotenona (um inibidor do complexo I). Ciclos de medição são repetido 8 vezes, após a adição de cada um inibidor mitocondrial.

No final dos ensaios, os valores médios de controlo 10 e 10 embriões tratadas quimicamente são calculados.

Parte 3: Oil-Red-O Coloração

1. Os embriões a 50 hpf são dechorionated utilizando uma pinça fina e fixadas em PFA a 4% durante a noite a 4 ° C.
2. Oil Red-O-coloração é realizada, tal como anteriormente descrito ² (ver Figura 4).

Resultados

Estamos interessados ​​em compreender o papel de genes específicos no metabolismo, especialmente a taxa de respiração e metabolismo lipídico. Portanto, tratamos os embriões zebrafish tipo selvagem a partir de 26 em diante HPF com um inibidor específico farmacológico da enzima codificada por um destes genes. Aos 50 hpf, metade do veículo e tratados com inibidor embriões foram analisados ​​utilizando o Seahorse para a função mitocondrial, enquanto a outra metade foi fixada em 4% de PFA durante a noite a 4 ° C e subsequentemente coradas durante a deposição de lípidos com Oil Red-O-. O tratamento com o inibidor da enzima específica conduziu a ~ um aumento de 2 vezes na respiração basal (Figura 4A), a qual estava associada a um aumento da deposição de lípidos, especialmente no telencéfalo e debaixo da vesícula ótica (Figura 4B, C).

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Figura 1. Representação esquemática do tratamento químico de embriões de zebrafish. Selvagem, geneticamente manipuladas, ou farmacologicamente tratada embriões zebrafish são de fundo.

Figura 2. XF24 placa ilhota configurado. (A) contêm quatro poços médio embrionário apenas como controlo de temperatura (marcado por um X) e os outros contêm um embrião / cavidade. (B) Close-up de um bem (C6) mostrando um 50 hpf embrião tipo selvagem tratados com o veículo (DMSO) coberto por uma tela de captura ilhota (seta).

Figura 3. Respiratparâmetros de iões de tipo selvagem 50 embriões zebrafish HPF. (A) Para cada medição, a média dos 20 embriões individuais são apresentadas. Respiração basal (média: 299,7; DP: 75,7; SEM: 16,9), respiração máxima (média: 387,4; DP: 93,3; SEM: 20,9), Capacidade respiratória Spare (média: 87,7; DP: 72,0; SEM: 16,1). (B) Para cada medição, a média dos resultados individuais 20 é apresentado. Respiração mitocondrial basal; respiração mitocondrial devido a ATP volume de negócios; respiração mitocondrial desacoplada e não-mitocondrial respiração. MT: mitocondrial; SRC: a capacidade respiratória Spare, DP: Desvio Padrão, SEM: erro padrão da média. Os resultados são apresentados em pmol de O ₂ consumido / min / embrião. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4. Repreresultados representativos da exposição a substâncias químicas sobre a respiração basal e deposição de lípidos. (A, B) de embrião de hpf 50 coradas com Oil Red O, em vista lateral. O embrião incubado com o inibidor selectivo (B) mostra a coloração mais Oil Red-O-, no telencéfalo (ponta de seta) e por baixo da vesícula ótica (seta) em comparação com um embrião de controlo tratado com veículo. (C) mostra uma respiração Basal ~ 2 vezes de aumento em embriões quimicamente tratado (n = 10 embriões por grupo). Os resultados são apresentados em pmol de O ₂ / min / embrião.

Discussão

Zebrafish é um modelo bem estabelecido genético para a frente (ENU mutagénese) e reverso (Tilling, dedo de zinco nuclease específica de knock-out, knockdown morfolino) abordagens genéticas ^3,4, enquanto que a função do gene em embriões de peixe-zebra também podem ser facilmente bloqueados ou activados selectivas compostos farmacológicos específicos para os produtos codificados. Devido ao seu desenvolvimento e externo pequeno tamanho, de embriões zebrafish são particularmente adequadas para análise metabólica. No entanto, a medição do perfil metabólico robusto e função mitocondrial in vivo em embriões de peixe-zebra não tenha sido alcançado, com apenas uma descrição preliminar relatada ^5. Análise Seahorse foi originalmente concebido para os estudos baseados em células metabólicas e tem sido demonstrado para dar resultados precisos e fiáveis ^​​6. A aplicação desta nova metodologia de embriões zebrafish é significativo, e provavelmente para aumentar o uso mais amplo deste modelo para estudos metabólicos.

Neste estudo, demonstramos a medição de uma série de parâmetros da respiração em embriões de peixes-zebra usando o Analisador Seahorse, incluindo respiração basal, respiração máxima, a capacidade respiratória de reposição, o volume de ATP e vazamento de prótons. Também fornecemos um exemplo de como tais medições podem ser correlacionados com outros parâmetros fisiológicos, neste caso, acumulação de lípidos e da utilização de inibidores farmacológicos neste sistema de ensaio. Combinado com o uso de embriões geneticamente alterados, isso proporciona uma poderosa plataforma experimental para a compreensão de fatores que impactam sobre o metabolismo.

Há uma variedade de aplicações para esta nova metodologia, com a disfunção mitocondrial está implicada em muitas doenças humanas, tais como Diabetes mellitus ^7, obesidade ^8, esclerose múltipla ^9, doenças de Parkinson ^10, a doença de Alzheimer ¹¹ e algum tipo de cancros ^12. É importante ressaltar que our trabalho é realizado in vivo, em que todas as influências ambientais - tais como as citoquinas, o desenvolvimento relacionado com o crescimento, etc - são activas, proporcionando assim uma vista fisiologicamente relevante na respiração vivo e metabólico. Como telas químicas também são rotineiramente realizados em tipo selvagem e mutantes de peixe-zebra embriões de fundo (Figura 1), produtos farmacêuticos novos que influenciaram a respiração, função mitocondrial ou metabolismo possam ser facilmente identificados utilizando o analisador Seahorse. Os resultados obtidos utilizando o analisador Seahorse poderia ser usado em conjunto com outros ensaios para fornecer informações adicionais. Isto pode incluir a análise fisiológico, tais como óleo de coloração vermelho-, ou a análise molecular, tais como hibridação in situ por adipócitos marcadores específicos tais como cebpα, PPARa, PPARy, etc FAS

Restam algumas limitações para esta metodologia. Embora nós e outros foram capazes de usar a medição oligomicinaure produção de ATP e de vazamento de protões em embriões jovens ⁵ (ver Figura 3), em embriões com mais de 60 tratamento oligomicina hpf é ineficiente. Acreditamos que em embriões mais antigos oligomicina não pode difundir tão facilmente do que em embriões jovens que fazem os resultados impossíveis de interpretar. Como os resultados oligomicina são obrigatórios para a determinação da respiração devido à ATP volume de negócios e respiração desacoplado, estamos investigando maiores concentrações de oligomicina de embriões mais velhos. No entanto, antimicina A tratamentos eficazes permanecem por mais tempo, com outras medidas, tais como a respiração basal, respiração e da capacidade respiratória máxima de reposição, podem ser realizados em embriões mais velhos zebrafish, até 68 hpf (não mostrado).

Outra limitação na utilização da configuração corrente Analyser Seahorse é o espaço físico no interior de cada uma das placas de captura de ilhota bem, de tal forma que eles só são adequados para os embriões zebrafish e larvas jovens. Portanto, a realização MetabolEstudos sobre ic obesidade induzida por dieta, em peixes adultos, por exemplo, ainda não é tecnicamente viável. No entanto, este estudo pode propiciar o desenvolvimento de placas projetadas especificamente para juvenis e adultos, ampliando assim o escopo de análises possíveis.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
XF 24 analisador de fluxo extracelular	Seahorse Bioscience	100737-101	24 formato bem
Islet microplaca de Captura	Seahorse Bioscience	101122-100	24 formato bem
XF solução de calibração	Seahorse Bioscience	100840-000
XF Médio Ensaio	Seahorse Bioscience	101022-100
Oil-Red-O	Sigma-Aldrich	O0625
1-fenil-2-tioureia (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 "target =" _blank "> http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51
E3 (médio embrionário)	Self made	-	http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16
100X15 milímetros placas de Petri	Falcão	35-1029
FCCP	Sigma	C2920
Oligomicina	Sigma	75351
Antimicina A	Sigma	A8674