Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио

Резюме

Данио представляют собой мощную модель позвоночных, которые были недостаточно используемых для метаболических исследований. Здесь мы опишем быстрым способом измерения В естественных условиях Метаболический профиль развивающихся данио рерио, что позволяет сравнивать различные параметры митохондриальной функции между генетически или фармакологически манипулировать эмбрионами, увеличивая тем самым применимость данного организма.

Аннотация

Все большее цели в области метаболизма, чтобы определить влияние генетики на различные аспекты функции митохондрий. Понимание этих отношений поможет понять этиологии для целого ряда заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией, такие как диабет и ожирение. Последние достижения в области приборостроения, позволило мониторинга различных параметров функции митохондрий в клеточных линиях или ткани эксплантов. Здесь мы представляем метод для быстрого и чувствительного анализа митохондриальной параметров функции в естественных условиях во время эмбрионального развития у рыбок данио помощью Seahorse биологических наук XF 24 внеклеточной анализатор потока. Этот протокол использует остров Capture микропланшеты, где один эмбрион помещается в каждую лунку, позволяя измерять биоэнергетики, в том числе: (i) базального дыхания; (II), базально митохондриального дыхания (III) митохондриального дыхания в связи с оборота АТФ; (IV) митохондриальной несвязанных дыхания или пр.отона утечки и (IV), максимальная дыхания. Используя этот подход эмбриональных параметров дыхания данио рерио могут быть сопоставлены между дикого типа и генетически измененных эмбрионов (мутант, ген избыточная экспрессия гена или нокдауна), или манипулируют фармакологически. Предполагается, что распространение этого протокола предоставит исследователям новые инструменты для анализа генетической основе метаболических нарушений в естественных условиях в данном соответствующие модели животных позвоночных.

протокол

Часть 1: химическая обработка эмбрионов данио рерио

1. Сбор эмбрионов рыбок данио после оплодотворения. Инкубировать при 28,5 ° С в среде E3 в 100 × 15 мм чашки Петри. Примечание: Для в гибридизация или масло-красно-O окрашивания, 1-фенил-2-тиомочевины (ПТУ) в конечной концентрации 0,2 мМ добавляют в ингибируют образование пигмента, ^1, но не является необходимым для Seahorse анализа.
2. Для фармакологических исследований, добавить необходимые химические вещества на соответствующие конечной концентрации развивающихся эмбрионов данио рерио в районе 26 часов после оплодотворения (ФВЧ) с соответствующим транспортным средством только контроль. Примечание: для светочувствительных фармакологических ингибиторов, эмбрионы могут быть позволено развиваться в темные до анализа.

Часть 2: Онлайн-профиль Метаболический с помощью Seahorse XF 24 Analyser

1. Перед каждым запуском, Seahorse XF 24 Analyser картридж, в котором размещается O ₂ и H + флуорофоров калибруется через автоматизированный процесс выполняется анализатор.
2. Подготовка 24-а XF 24 островке пластины. Следующие экспериментальные последовательность используется:
   1. Так как потребление кислорода чувствительны к колебаниям температуры, четыре скважины используются для контроля за возможными колебаниями температуры по всей пластине. Эти скважины не содержат эмбрионы, но наполнены 700 мкл E3 среде (рис. 2A).
   2. Остальные 20 скважин (см. п. 2.2) заполняют 700 мкл E3 среднего и одного эмбриона каждый (рис. 2В).
   3. Для каждого эксперимента 10 эмбрионов относятся с транспортным средством только (контроля) и 10 обрабатывают химическим ингибитором (лечение). Контроль и обработанных эмбрионов чередуются (например, хорошо A2: контроль эмбриона, хорошо A3: обработанных эмбрионов: ну A4: контроль эмбриона, хорошо A5 рассматривать эмбрион, и т.д.).
   4. Островок захвата экрана добавляется в верхней части. каждую лунку, чтобы убедиться, что образец остается в измерительной камере по всему анализа (рис. 2В) Примечание: химически обработанных эмбрионов остаются с оригинальным решением химического течение всей процедуры, без необходимости, чтобы смыть химические перед запуском Seahorse анализатора программы.
   5. После завершения пластины загружаются в Seahorse Analyser и анализа запущен.
3. Анализ образцов. Две различные анализы регулярно проводится.
   1. Базальная дыхания / Максимальный дыхания программы (продолжительностью около 90 мин.). Изменения в базальную дыхания лежат в основе метаболической дисфункции, в то время как максимальная дыхания является мерой общей мощностью производства энергии и изменение этого параметра связано с количеством и патологических и физиологических состояний. Резервные мощности дыхательных путей, или способность к системе для дальнейшего увеличения производства АТФ, также вычисляетсяИз этого теста путем вычитания базальной от максимального дыхания. Три повторов каждой смеси (2 мин) / ожидания (1 мин) / измерения (2 мин) цикл выполняется сначала установить базального дыхания. В конце третьего цикла, конечной концентрации 2,5 мкМ FCCP (митохондриальная протонофора / разобщитель) добавляли в каждую лунку позволяет измерение максимальной дыхания. Цикл измерения повторяется от 5 до 8 раз (рис. 3).
   2. ATP оборота / Протон утечка программы (продолжительностью около 60 мин.). Дыхание в связи с оборота АТФ представляет собой основную функцию митохондрий в форме производства АТФ, в то время как дыхание в связи с утечкой протонов, или несвязанных дыхания, неразрывно связан с другими параметрами функции митохондрий, в том числе базального дыхания и активных форм кислорода. Дыхание в связи с оборота АТФ представлена ​​разница в дыхании после добавления 25 мкМ олигомицином (ингибиторTP-синтазы) по сравнению с базальным дыхания. Несвязанных дыхание, или дыхание в связи с утечкой протонов, определяется путем вычисления разницы между олигомицином-опосредованной дыхание и дыхание после добавления 25 мкМ ротенон (комплекс ингибитор I). Измерение циклы повторяются 8 раз после добавления каждого митохондриальных ингибиторов.

В конце трассы, средние значения 10 контрольных и 10 химически обработанных эмбрионов рассчитываются.

Часть 3: Oil-красно-O Окрашивание

1. Эмбрионы на 50 HPF которые dechorionated с использованием тонких щипцов и фиксировали в 4% PFA в течение ночи при 4 ° C.
2. Нефть-красно-O окрашивание выполняется, как описано выше ² (см. рисунок 4).

Результаты

Мы заинтересованы в понимании роли определенных генов на обмен веществ, в частности, частоты дыхания и липидного обмена. Таким образом, мы относились к диким эмбрионы рыбок данио типа с 26 года ФВЧ с определенной фармакологической ингибитор фермента, кодируемого одним из этих генов. В 50 HPF, половина из транспортного средства и ингибитора обработанных эмбрионов были проанализированы с помощью Seahorse для функции митохондрий, в то время как оставшаяся половина были зафиксированы в 4% PFA в течение ночи при 4 ° C, а затем окрашивают в течение отложения липидов с маслом-красно-O. Лечение с помощью специфического ингибитора фермента привело ~ 2 раза в базальных дыхания (рис. 4а), который был связан с увеличением в липидных отложений, особенно в конечный мозг и под слухового пузырька (рис. 4 б, в).

pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. Схематическое изображение химической обработки эмбрионов данио рерио. Дикого типа, генетически манипулировали, или фармакологически рассматриваться эмбрионов рыбок данио являются фоном.

Рисунок 2. XF24 островок пластины созданы. (А) четыре скважины содержат эмбриональные среде только как контроль температуры (отмечены X) и другие содержат одного эмбриона / лунку. (B) Крупным планом одной скважины (C6), показывающий на 50 HPF дикого типа эмбриона обрабатывают транспортного средства (ДМСО) покрывается островок захвата экрана (стрелки).

Рисунок 3. Respiratионных параметров для дикого типа 50 эмбрионов данио рерио HPF. (A) для каждого измерения, среднее значение 20 отдельных эмбрионов представлено. Базальная дыхания (в среднем 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), максимальная дыхания (в среднем 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), запасные емкости пневмонии (среднее: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) для каждого измерения, среднее значение 20 индивидуальных результатов представлена. Базальная митохондриального дыхания; дыхание митохондрий в связи с СПС оборота; митохондриальных несвязанные дыхание и не митохондриального дыхания. Mt: митохондриальная; SRC: Запасные респираторных потенциала; SD: Стандартное отклонение, SEM: Стандартная ошибка среднего. Результаты представлены в пмоль O ₂ потребляемого / мин / эмбрионов. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4. Предстатель результаты химического воздействия на базальные дыхания и липидов осаждения. (A, B) 50 HPF эмбриона окрашивают масляной Red O при взгляде сбоку. Эмбриона инкубируют с селективным ингибитором (B) отображает более Нефть-красно-O окрашивание в конечном мозге (стрелки) и под слухового пузырька (стрелка) по сравнению с обработанных носителем управления эмбриона. (C) Базальные дыхания показывает ~ 2 раза в химически обработанных эмбрионов (n = 10 эмбрионов в группе). Результаты представлены в пмоль O ₂ / мин / эмбрионов.

Обсуждение

Данио рерио является устоявшейся генетической моделью для обоих вперед (ЕНУ мутагенеза) и обратный (пахоты, цинковый палец нуклеазы целевых нокаут, нокдаун морфолино) генетические подходы ^3,4, в то время как функции генов у эмбрионов данио рерио также может быть легко заблокированы или активированный с использованием селективных фармакологических соединений, специфичных для закодированных продуктов. Благодаря своим внешним развитием и небольшой размер, эмбрионы рыбок данио являются особенно подходящими для метаболического анализа. Тем не менее, надежных измерений метаболического профиля и функции митохондрий в естественных условиях у эмбрионов данио рерио не было достигнуто, с одной лишь предварительное описание сообщил ^5. Seahorse анализ был первоначально разработан для клеточных исследований метаболических и было продемонстрировано, чтобы дать точные и надежные результаты ^6. Применение этой новой методологии эмбрионов данио рерио является значительным, и, вероятно, для усиления широкого использования этой модели для метаболических исследований.

В этом исследовании мы демонстрируем, измерение спектра параметры дыхания у эмбрионов данио рерио использование Seahorse Analyser, в том числе базальных дыхания, максимальная дыхания, дыхательный запасных мощностей, ATP оборота и утечки протонов. Мы также предоставляем пример того, как такие измерения могут быть соотнесены с другими физиологическими параметрами, в это накопление липидов случае, и использование фармакологических ингибиторов в этом анализе системы. В сочетании с использованием генетически измененных эмбрионов, это обеспечивает мощную экспериментальную платформу для понимания факторов, влияющих на обмен веществ.

Есть множество приложений для этой новой методологии, с митохондриальной дисфункцией замешан во многих человеческих болезней, таких как сахарный диабет ^7, ожирение ^{8, 9} рассеянного склероза, болезни Паркинсона ^10, болезнью Альцгеймера ¹¹ и некоторых типов рака ^12. Важно отметить, что оУра работы выполняются в естественных условиях, где все воздействия окружающей среды - таких как цитокины, связанных с развитием и т.д. роста - активны, тем самым обеспечивая физиологически соответствующего вида в естественных условиях дыхания и метаболический профиль. Как химические экраны также регулярно проводится в дикого типа и мутантных эмбрионов данио рерио фоне (рис. 1), роман фармацевтической, что влияние дыхание, митохондрии функцию и метаболизм могут быть легко определены с помощью Seahorse анализатора. Результаты создан с помощью Seahorse анализатор может быть использован в сочетании с другими анализы для предоставления дополнительной информации. Это может включать физиологического анализа, таких, как нефть-красные пятна, или молекулярного анализа, таких, как гибридизация для специфических маркеров адипоцитов, таких как cebpα, Pparα, PPAR-гамма, ФАС и т.д.

Там остаются некоторые ограничения в этой методологии. Хотя мы и другие были в состоянии использовать олигомицином для измеренияЮр производство АТФ и протонного утечки на молодых эмбрионов ⁵ (см. Рисунок 3), в эмбрионы старше 60 лет лечение HPF олигомицином неэффективно. Мы считаем, что в старых эмбрионов олигомицином не могут диффундировать так же легко, чем у более молодых эмбрионов делает результаты невозможно интерпретировать. С олигомицином результаты являются обязательными для определения дыхания из-за ATP оборота и несвязанных дыхание, мы в настоящее время исследуем более высоких концентрациях олигомицином пожилых эмбрионов. Тем не менее, антимицином лечения остаются в силе дольше, с другими измерениями, такими как базальные дыхания, максимальная дыхания и запасных дыхательной емкости, могут быть выполнены в старых эмбрионов данио рерио, до 68 HPF (не показано).

Еще одно ограничение в использовании текущие настройки анализатора Seahorse является физическое пространство внутри каждого островка пластина захвата, например, такие, что они пригодны только для эмбрионов данио рерио и молодых личинок. Таким образом, выполнение metabolIC исследований по диете вызванных ожирением у взрослых рыб, например, еще не технически возможно. Однако, это исследование может подтолкнуть развитие пластин, специально предназначенных для несовершеннолетних или взрослых рыб, тем самым расширяя сферу анализа возможных.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
XF 24 внеклеточной анализатор потока	Seahorse Bioscience	100737-101	24-луночный формат
Островок Capture микропланшетов	Seahorse Bioscience	101122-100	24-луночный формат
XF Calibrant решение	Seahorse Bioscience	100840-000
XF среды для анализа	Seahorse Bioscience	101022-100
Нефть-красно-O	Sigma-Aldrich	O0625
1-фенил-2-тиомочевины (ПТУ)	Sigma-Aldrich	P7629	/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 "целевых =" _blank "> http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51
E3 (эмбриональные среды)	Самодельный	-	http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16
100x15 мм чашки Петри	Сокол	35-1029
FCCP	Сигма	C2920
Олигомицин	Сигма	75351
Антимицином	Сигма	A8674