Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Resumo

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Resumo

Interacção de plaquetas e leucócitos activados (sobretudo neutrófilos) no endotélio activado trombose e medeia a inflamação vascular. ^1,2 Durante a formação do trombo no sítio da lesão arteriolar, plaquetas aderentes ao endotélio activado e proteínas da matriz subendotelial suporte de rolamento dos neutrófilos e adesão ^3. Por outro lado, sob condições inflamatórias venulares, os neutrófilos aderentes ao endotélio activado pode suportar a adesão e acumulação de plaquetas circulantes. Agregação de plaquetas de neutrófilos heterotípica requer processos sequenciais pelas interacções específicas do receptor de contra-receptor entre as células. ⁴ Sabe-se que células endoteliais activadas libertar as moléculas de adesão, tais como o factor de von Willebrand, iniciando assim a adesão de plaquetas e acumulação sob condições de alto cisalhamento. ⁵ Além disso, células endoteliais ativadas apoiar rolamento e adesão de neutrófilos por selectinas expressando umad molécula-1 de adesão intercelular (ICAM-1), respectivamente, sob condições de baixo cisalhamento. Platelet ⁴ P-selectina interage com os neutrófilos a P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induzindo deste modo a activação de neutrófilos β2 integrinas e firmes a adesão entre dois tipos de células. Apesar dos avanços nas experiências in vitro em que heterotípicas plaquetas de neutrófilos interacções são determinados em sangue completo ou células isoladas, ^6,7 desses estudos não é possível manipular as condições de stress oxidante durante a doença vascular. Neste relatório, utilizando fluorescentemente marcados, os anticorpos específicos contra um rato de plaquetas e neutrófilos marcador, nós descrevemos um protocolo detalhado microscópica intravital para monitorar interacções heterotípicas de plaquetas e neutrófilos no endotélio activado durante TNF-α induzida por inflamação ou seguindo induzida por laser lesão no músculo cremaster microvasos de camundongos vivos.

Protocolo

1. Preparação de microscópio intravital (Figura 1A)

1. Preparar tampão de superfusão (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM _CaCl2, 1 mM _de MgCl2, e 17 mM _de NaHCO3, pH 7,4).
2. Transformar-se num banho de água para manter a temperatura circulatório de tampão e um cobertor de termo-regulado a 37 ° C. Arejar tampão com gás de azoto (5% de CO ₂ equilibrada com azoto).
3. Ligue o sistema de microscópio (Sutter Lambda DG-4 de alta velocidade de onda changer, trabalho com computador, microscópio Olympus BX61W, MPC-200 de multi-manipulador, o ROE-200 controlador de fase, câmera de alta velocidade, e intensificador).
4. Para o modelo de inflamação vascular, usar um espelho dicróico de 100%. Para induzir a formação de trombos por uma lesão laser, substituir um espelho 100% com um espelho de 50/50% e ligar um sistema de ablação por laser Micropoint.

2. Preparação do músculo cremaster para microscopia intravital (Figura 1B)

1. Anestesiar umrato macho (6-8 semanas de idade, ratinhos C57BL / 6) por injecção ip de cetamina (125 mg de peso corporal / kg (PC)) e xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). A Universidade de Illinois Animal Care Institucional e Comitê de Uso aprovado todo o cuidado animal e procedimentos experimentais. Para um modelo de inflamação vascular, injectar murina TNF-α (0,5 ug em 250 uL de solução salina) intrascrotally num rato hr 3 antes de imagiologia (2-2,5 horas antes da cirurgia).
2. Colocar o rato sobre um cobertor de termo-regulado a 37 ° C num tabuleiro de microscópio intravital.
3. Puxar para cima da pele sobre a superfície do gargalo e com a pinça incisão horizontal da linha média da pele do pescoço até 1 cm com uma tesoura.
4. Abra cuidadosamente a musculatura cervical com uma tesoura sem corte e retire o músculo ao redor da traquéia.
5. Canular um tubo PE90 na traqueia para eliminar a dificuldade de respiração.
6. Remover suavemente o lado esquerdo do músculo do colo do útero e isolar a veia jugular dos tecidos vizinhos.
7. C annuum tubo PE10 tarde na veia jugular esquerda para infusão de anestésicos e de anticorpos adicionais.
8. Retire cuidadosamente e incisão na pele do escroto horizontalmente. Para manter a integridade do tecido ao longo do experimento, tampão pré-aquecido foi superfundidos sobre o campo cirúrgico.
9. Pressione na parte inferior do abdômen com uma pinça e retire cuidadosamente um testículo com a pinça outro.
10. Remover os tecidos conjuntivos circundantes em torno dos testículos.
11. Faça uma incisão no músculo cremaster verticalmente e achatar o músculo mais de uma lamela de vidro em uma bandeja de microscópio intravital fixando a periferia.
12. 10-20 min para permitir que o músculo se estabilizar antes da recolha de dados. Arteríolas do músculo cremaster (para a formação de trombo) e vénulas (por inflamação vascular), com um diâmetro de 30-45 mM foram escolhidos para o nosso estudo.
13. Para manter as condições de anestesia, infundir 30-50 ml do mesmo anestésico min aproximadamente a cada 30 através do cannulus jugular.

3. Microscopia intravital para TNF-α induzida por inflamação vascular

1. Após a colocação do mouse sobre o microscópio intravital, aberto SlideBook software 5.0 e clique em "Janela de foco" na barra de menu para definir a ótica adequadas e objetivas (60X).
2. Infundir Dylight 488-conjugado de rato anti-ratinho CD42c (0,1 ug / g BW em 100 ul de solução salina) e Alexa Fluor 647-conjugados de rato anti-ratinho Gr-1 anticorpos (0,05 ug / g BW em 100 ul de solução salina) através de uma veia jugular cannulus .
3. Vá para a barra de menu, e clique em "Captura de Imagem" na barra de ferramentas.
4. Um novo menu irá aparecer, em "Imagem", selecione "Fator de Bin", como 1x1 e selecione "640" na largura e "460" na altura.
5. Em "Set Filter", marque a caixa de seleção para os canais que você gostaria de expor e definir o tempo de exposição para cada um. Por exemplo, o canal aberto: 10 ms, FITC canal: 50 ms, e Cy5 canal: 50 ms.
6. Selecione "Capture Time-Lapse" para ajustar o número de pontos de tempo e intervalo. For o modelo de inflamação, o número de pontos de tempo é definido como 1000-1500 com um intervalo de 200 msec (tempo decorrido Total: 5 min).
7. Clique em "Test" para ver uma imagem única avião no tempo de exposição especificado para aquele canal. Ajustar o tempo de exposição e / ou da luz do microscópio até que o histograma mostra uma distribuição de intensidade adequada (para multi-canal de captura, repetir esse processo para cada canal).
8. Depois de todos os parâmetros são definidos (canais, tempos de exposição, e assim por diante) no "Captura de Imagem", selecione "Iniciar" para começar a captura.
9. Monitorar plaquetas rolantes e aderente e neutrófilos durante 5 min na metade superior de uma vénula cremaster inflamada no modelo de inflamação vascular. Oito a dez diferentes vénulas são gravados em um rato.
10. As imagens foram tiradas com uma ampliação total de 60X (1,0 NA objetivo imersão em água), dando um tamanho de janela de 157 x 118 mM mM.
11. Após a conclusão da experiência, os ratos foram sacrificados via cervical dislocation.

4. Análise de Dados para o Modelo de Inflamação venular

1. Abra SlideBook software 5.0 e clique em "Pasta" na barra de menu para abrir um arquivo.
2. Clique no menu drop-down canal e selecione "Abrir, FITC, Cy5, etc"
3. Clique em "renormalizar (barras vermelhas e verdes)" e selecionar o canal. Arrastar as barras vermelhas e verdes para a esquerda ou para a direita a aproximadamente optimizar o sinal de fluorescência.
4. Clique em "Aplicar" e "OK" para atualizar a imagem.
5. Clique em "Botão Miniatura" para selecionar a exibição atual como padrão.
6. Jogar imagem timelapse capturado, e contar neutrófilos rolamento e aderentes durante o período de 5 min.
7. Para analisar a formação de trombos de plaquetas, vá para "Máscara" e selecione "Criar".
8. Nome de uma máscara e marca "Na imagem atual".
9. Clique em "ícone do lápis Grande" em "Marquee Tool" na tela principal.
10. Colorir uma região fora da embarcação na vista principal para definir uma máscara de fundo.
11. Ir to "Máscara", clique em "Copiar este plano", clique em "Copiar máscara no ponto de tempo atual" e selecione "Todos os instantes", e clique em "OK".
12. Para calcular sinal de fundo, vá em "Estatísticas" e clique em "Estatísticas máscara".
13. Clique em "Current Time Lapse 2D ou 4D Imagem (s)" no Âmbito da imagem, e selecione "máscara inteira" no escopo de máscara. Em Recursos, selecione "O tempo decorrido (hh: mm: ms)" em data de captura, selecione "Área (pixels)" em Morfometria, selecione "intensidade máxima" em intensidade, e clique em "Export" (Este método estatístico que nos permite calcular automaticamente a intensidade de fluorescência (sinal de fundo)).
14. Abra o ficheiro de texto em MS Office Excel e calcular o valor médio do sinal de fundo durante todo o período de gravação. Esta é a intensidade de fluorescência de fundo.
15. Para determinar a intensidade do trombo, clique em "ícone do lápis grande" novamente no "Marquee Tool" na tela principal.
16. Cor dentro do vaso na vista principal para definir o sinal de plaquetas.
17. Vá em "Máscara", clique em "Copiar este plano", clique em "Copiar máscara no ponto de tempo atual", selecione "Todos os instantes", e clique em "OK".
18. Vá em "Estatísticas" e clique em "Estatísticas máscara".
19. Clique em "Current Time Lapse 2D ou 4D Imagem (s)" no Âmbito da imagem, e selecione "máscara inteira" no escopo de máscara. Em Recursos, selecione "O tempo decorrido (hh: mm: ms)" em data de captura, selecione "Área (pixels)" em Morfometria, selecione "Intensidade Soma" em intensidade, e clique em "Export" (Este método estatístico nos permitem o cálculo da intensidade de fluorescência no interior do vaso).
20. Abra o arquivo de texto no MS Office Excel. Sinal de fluorescência das plaquetas é calculado subtraindo-se o valor médio da área de fundo x intensidade (pixel) a partir da intensidade da soma do interior do vaso. Esta é a intensidade de fluorescência do trombo plaquetário.
21. Repetir este em 30 vénulas diferentes em 3-5 ratos diferentes. Em seguida, calcular o valor médio da intensidade de fluorescência das plaquetas.
22. Paraanalisar o rolamento dos neutrófilos e adesão, o influxo de rolamento dos neutrófilos foi determinada ao longo de 5 min em cada vénula e apresentados como o número de células por minuto. O número de neutrófilos aderentes que foram fixas durante> 30 segundos e, lentamente, rastreado (<10 fim ao longo de 30 s), mas não rolar, foram contados e apresentados como o número de células por 5 min.

5. Microscopia intravital para laser induzida trombose arteriolar

5-1 Calibração do laser de ablação

1. Coloque uma corrediça espelhada em platina do microscópio, aplicar uma pequena gota de água destilada para a parte superior da lâmina, e ajuste da intensidade e da focagem utilizando a ocular.
2. Abrir "janela de foco" e selecione a opção "FRAP" guia na SlideBook software 5.0.
3. Definir a potência do laser em 40-50, e definir os dois "repetições duplo clique" e "tamanho duplo clique" para 8. Marque sobre o "Guia" caixa para abrir um conjunto de mira.
4. Selecione a opção "Arrow" ícone na barra de tarefas on parte superior da tela.
5. Sob o "FRAP Alinhamento", clique em "Fogo seguinte". Uma pequena mancha deve aparecer perto do canto inferior esquerdo do monitor. Uma vez que o local aparece, dê um duplo clique no centro dela. Uma vez clicado, outro ponto deve aparecer acima e à direita do primeiro ponto; clique duas vezes sobre ele. Repita este procedimento para os 16 pontos (o local 16 ^ª aparecerá no canto inferior direito). Clique em "Salvar" quando terminar de atualizar os parâmetros de calibração.
6. Para testar a precisão da calibragem, clique sobre o "Centro" local-um pequeno botão deve aparecer no centro da tela. Se não, repita a calibração até que a precisão desejada seja atingida.

5-2 laser induzida por formação de trombo arteriolar

1. Colocar um rato anestesiado (ver o procedimento de 2-2 a 2-12) na platina do microscópio.
2. Sob a "captura" janela, selecione um protocolo ou criar um novo. As configurações são as seguintes: CY5 (70 exposição ms), Open (10 msec exposição) e FITC (50 exposição msec). Imagem é capturada mais de 20 min (aproximadamente 2.400 pontos de tempo com um intervalo de tempo de 500 ms).
3. Infundir Dylight 488-anti-rato conjugado e CD42c Alexa Fluor 647-conjugados anti-ratinho Gr-1 anticorpos, tal como descrito acima.
4. Otimizar os parâmetros de microscópio incluindo intensidade de fluorescência e imagem de campo claro como descrito em 3-3 para 3-7.
5. Clique no botão "Teste" para garantir a intensidade de campo claro adequada ou sinal de anticorpos, colocação arteríola e foco.
6. Clique em "Iniciar" para iniciar o processo de captura de imagem.
7. Antes de disparar o laser de ablação, certifique-se de que o ícone ponteiro do mouse foi selecionado e que a parede do reservatório está em foco claro.
8. Para disparar o laser, clique duas vezes em um ponto 2-3 mM internamente a partir da parede do vaso. Lesão das células endoteliais arteriolares provoca uma alteração de forma visual, que deve ser aparente na imagem de campo claro, seguindo-se a acumulação de plaquetas. Monitor de tromboformação, durante 5 min após a lesão laser.
9. Cinco minutos após a lesão de laser (do tamanho do trombo agora deve ser estável) pausar e cancelar a captura. Subsequentemente, iniciar uma captura com 2400 pontos de tempo com um intervalo de 500 msec para gravar plaquetas aderentes e neutrófilos rolantes / aderente durante 20 min. Três a cinco arteríolas são gravados em um rato.
10. Após a conclusão da experiência, os ratos foram sacrificados através de deslocação cervical.

6. Análise de Dados para o Modelo de Trombose arteriolar

1. Vá passos 4,1 por 4,5.
2. Para obter a intensidade de fluorescência de fundo durante a formação de trombos de plaquetas, passar por cima de passos 4,7 por 4,14.
3. Vá em "Máscara", clique em "Segmento", selecione FITC no canal, e inserir o valor médio do sinal de fundo em baixa. Clique em "Aplicar" e "OK".
4. Para a análise da intensidade de fluorescência de trombos plaquetários (Dylight 488-conjugado anticorpo anti-CD42c), passar por cima de passos 4,18 por 4,19. Para o cálculo do sinal de anticorpo, "Intensity Sum" é subtraído do sinal de fundo ("Intensidade máxima" x "da área (pixels)"). Esta é a intensidade de fluorescência do trombo plaquetário.
5. Para quantificar os neutrófilos rolantes e aderente, desempenham o lapso de tempo e contar o número de células que visivelmente rolam ao longo dos trombos de plaquetas durante 20 min. Rolamento é definido como uma diminuição na velocidade dos neutrófilos ao interagir com o trombo de plaquetas durante pelo menos 2 segundos. Neutrófilos aderentes são definidos como quaisquer neutrófilos que permanecem ligados às trombo plaquetário durante pelo menos 2 min. O número de neutrófilos rolantes e aderente foi apresentada como o número de células por 20 min. Velocidade de rolamento foi calculado usando um sistema de rastreamento de partículas.

Resultados

Usando a análise de microscopia intravital detalhada, heterotípicas plaquetas de neutrófilos interações no endotélio activado foram visualizadas por infusão de anticorpos marcados com fluorescência contra uma plaqueta (CD42c) ou marcador de neutrófilos (Gr-1) em murganhos vivos.

Em um modelo de TNF-α induzida por inflamação venular, neutrófilos rolantes foram estavelmente mais aderido ao endotélio, presumivelmente através da interacção de β2 integrinas activadas com ICAM-1 ...

Discussão

Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado em tempo real a microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e trombose. Anteriormente, semelhantes de fluorescência abordagens microscópicas foram relatados para estudar o mecanismo molecular da formação de trombos e de inflamação vascular. ^8,12 Uma vez que a interacção célula-célula heterotípica pode ser importante para a vaso-oclus...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	10035-04-8
MgCl2 6H2O	Fisher Scientific	7791-18-6
NaHCO3	Fisher Scientific	144-55-8
0.9% NaCl Saline	Hospira	0409-4888-10
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine	Lloyd
Intramedic Tubing (PE 90)	BD Diagnostics	427421
Intramedic Tubing (PE 10)	BD Diagnostics	427401
Murine TNF-α	R&D Systems	410-MT
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody	Emfret Analytics	X488
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody	BioLegend	108418
NESLAB EX water bath/circulator	Thermo-Scientific
Olympus BX61W microscope	Olympus
TH4-100 Power	Olympus
Lambda DG-4	Sutter
MPC-200 multi-manipulator	Sutter
R–-200 stage controller	Sutter
C9300 high-speed camera	Hamamatsu
Intensifier	Video Scope International
Ablation Laser	Photonic Instruments, Inc.
SlideBook 5.0	Intelligent Imaging Innovations