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요약

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

초록

arteriolar 부상의 사이트에서 혈전 형성을하는 동안 활성화 된 내피의 mediates 혈전증과 혈관 염증에 활성화 된 혈소판 및 백혈구 (주로 호중구)의 상호 작용. 1,2, 활성화 내피와 subendothelial 매트릭스 단백질 자기편 혈소판은 호중구 압연과 접착력을 지원합니다. 3 반대로, venular 염증성 조건 하에서, 활성화 내피에 점착성의 호중구는 혈소판을 순환의 접착력과 축적을 지원할 수 있습니다. Heterotypic 혈소판 호중구 집계는 세포 사이의 특정 수용체 카운터 수용체의 상호 작용에 의해 순차적 프로세스를 필요로합니다. 4 그것은이 활성화 내피 세포는 따라서 높은 전단 조건 하에서 혈소판 부착 및 축적을 시작, 같은 폰 Willebrand 인자로 접착 분자를 풀어 알려져 있습니다. 5 또한, 활성화 내피 세포는 표현 selectins에 의한 호중구의 압연과 접착력을 지원D 세포 유착 분자 -1 (ICAM-1), 각각 낮은 전단 조건 하에서 4. 혈소판 P-selectin이 통과 호중구와 상호 작용하는 P-selectin 당 단백질 리간드-1 (PSGL-1),이를 호중구 β2 integrins 및 회사의 활성화를 유도 두 세포 유형 간의 접착. heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용이 전체 혈액 또는 절연 세포, 6,7에서 결정되는 체외 실험에서의 발전에도 불구하고 그 연구는 혈관 질환 중 산화제 스트레스 조건을 조작 할 수 없습니다. 이 보고서에서, 혈소판 및 호중구 마커 마우스에 대한 휘황 라벨이 지정된 특정 항체를 사용하여, 우리는 TNF-α 유도 염증이나 레이저 유도에 따라하는 동안 활성화 된 내피에 혈소판과 호중구의 heterotypic 상호 작용을 모니터링 할 수있는 자세한 intravital 미세한 프로토콜을 설명 라이브 쥐 cremaster 근육 microvessels 부상.

프로토콜

1. Intravital 현미경의 준비 (그림 1A)

  1. (125 MM NaCl, 4.5 MM KCl, 2.5 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 17 MM NaHCO 3, pH를 7.4) superfusion 버퍼를 준비합니다.
  2. 37 버퍼의 온도 및 온도 제어 이불을 유지하기 위해 순환 물 목욕을 켜 ° C. 질소 가스 (5 % CO 2 질소와 균형)으로 버퍼를 폭기.
  3. 현미경 시스템을 켜십시오 (셔터 람다 DG-4 고속 파장 변환기, 워크 스테이션 컴퓨터, 올림푸스 BX61W 현미경, MPC-200 멀티 속이는, 교전 규칙-200 무대 컨트롤러, 고속 카메라, 강화제).
  4. 혈관 염증 모델의 경우 100 % 이색 성 거울을 사용합니다. 레이저 부상으로 혈전 형성을 유도하기 위해 50분의 50 %의 거울 100 % 미러를 교체하고 micropoint 레이저 어블 레이션 시스템을 켜십시오.

2. Intravital 현미경에 대한 Cremaster 근육의 준비 (그림 1B)

  1. 를 마취케타민 (125 밀리그램 / kg 체중 (BW))과 xylazine의 IP 주입 (12.5 밀리그램 / kg BW)으로 남성 마우스 (6-8주, 이전 C57BL / 6). 일리노이 기관 동물 케어 및 사용위원회의 대학은 모든 동물의 보호와 실험 절차를 승인했다. 혈관 염증 모델의 경우 (수술하기 전에 2-2.5 시간) 이전 이미지에 intrascrotally 마우스를 3 시간에 손쥐 TNF-α를 (250 μl 생리의 0.5 μg) 주입.
  2. intravital 현미경 트레이에 37 ° C에서 온도 제어 담요 위에 마우스를 놓습니다.
  3. 집게를 사용하여 목의 표면에 피부를 당겨, 최대 가위로 1cm에 수평으로 목 피부의 중간 선을 절개.
  4. 부드럽게 무딘 가위를 사용하여 자궁 근육을 열고기도를 둘러싼 근육을 제거합니다.
  5. 호흡 곤란을 제거하는 기관에 PE90 튜브를 Cannulate.
  6. 부드럽게 목 근육의 왼쪽을 제거하고 주변 조직에서 경정맥 정맥을 분리.
  7. C annu항체 및 추가 anesthetics의 주입은 왼쪽 경정맥 정맥에 늦게 PE10 튜브.
  8. 부드럽게 꺼내 수평으로 scrotal 피부를 절개. 실험을하는 동안 조직의 무결성을 유지하려면 prewarmed 버퍼는 수술 분야를 통해 superfused되었습니다.
  9. 한 forcep으로 낮은 복부에 눌러 조심스럽게 다른 forcep과 고환을 당겨.
  10. testis 주변의 주변의 결합 조직을 제거합니다.
  11. 수직 cremaster 근육을 절개하고 주변을 달아하여 intravital 현미경 트레이에 유리 coverslip 위에 근육을 평평하게.
  12. 이전 데이터 수집에 안정화 할 수있는 근육에 10-20 분 소요됩니다. 30-45 μm의 직경 Cremaster의 근육 arterioles (혈전 형성을위한)과 정맥은 (혈관 염증에 대한) 우리의 연구에 선정되었습니다.
  13. 마취 조건을 유지하기 위해 동일한 마취 목 cannulus을 통해 약 매 30 분 30-50 ML을 불러 일으킬.

3. TNF-α 유도 혈관 염증에 대한 Intravital 현미경

  1. intravital 현미경, 오픈 SlideBook 5.0 소프트웨어에 마우스를 배치 한 후에 적절한 광학 및 목표 (60X)을 설정하는 메뉴 바의 "초점 창 '을 클릭합니다.
  2. Dylight을 불러 일으킬 488 - 복합 쥐 안티 - 마우스 CD42c (100 μl 생리의 0.1 μg / g BW)와 알렉사 형석 647-복합 쥐 안티 - 마우스 GR-1 항체 (100 μl 생리에서 0.05 μg / g BW) 목 cannulus을 통해 .
  3. 메뉴 표시 줄로 이동하여 도구 모음에서 "이미지 캡처"를 클릭하십시오.
  4. 새 메뉴가 나타납니다; "이미지"에서 높이의 "460"을 1x1로 "빈 팩터"를 선택하고 '640 "너비에합니다.
  5. "필터 설정"에서 각 노출 시간 노출 및 설정하고자하는 채널에 대한 확인란을 선택합니다. 예를 들어, 오픈 채널 : 10 밀리 초, FITC 채널 : 50 밀리 초 및 Cy5 채널 : 50 밀리 초.
  6. 시간 포인트와 간격의 수를 조정하려면 "시간 경과 캡처 '를 선택합니다. 정R 염증 모델은, 시간 포인트의 수는 200 밀리 초의 간격 (5 분 총 경과 시간)을 1,000-1,500으로 설정되어 있습니다.
  7. 해당 채널에 대한 지정된 노출 시간에 단일 비행기 이미지를 볼 수 있습니다 "테스트"를 클릭하세요. 히스토그램은 충분한 강도 분포 (멀티 채널 캡처를 들어, 각 채널에 대해이 과정을 반복)을 보여줍니다까지 노출 시간 및 / 또는 현미경 빛을 조정합니다.
  8. 일단 모든 매개 변수가 "이미지 캡처"에 (채널, 노출 시간 등) 설정, 캡처를 시작하려면 "시작"을 선택합니다.
  9. 혈관 염증 모델에서 염증 cremaster의 세정맥의 상단에 5 분을위한 압연 및 점착성의 혈소판과 호중구를 모니터링합니다. 8 10 개 정맥은 한 마우스에 기록됩니다.
  10. 이미지는 157 μm X 118 μm의 창 크기를 제공 60X의 총 배율을 (1.0 NA 물 침적 목표)를 사용하여 촬영 된 것입니다.
  11. 실험이 완료되면, 마우스는 자궁 경부 dislocatio 통해 euthanized되었다N.

4. Venular 염증 모델에 대한 데이터 분석

  1. SlideBook 5.0 소프트웨어를 열고 파일을 열려면 메뉴 바에서 "폴더"를 클릭하십시오.
  2. 드롭 다운 채널 메뉴를 클릭하고 "열기, FITC, Cy5 등"을 선택
  3. "(빨간색과 초록색 막대) Renormalize"와 채널을 선택을 클릭합니다. 약 형광 신호를 최적화 할 왼쪽 또는 오른쪽으로 빨간색 막대와 녹색 막대를 드래그합니다.
  4. "적용"및 "확인"을 이미지를 업데이트를 클릭합니다.
  5. 기본값으로 현재 디스플레이를 선택하려면 '미리보기'버튼을 클릭합니다.
  6. 캡처 timelapse 이미지를 재생하고, 5 분 기간 동안 압연과 점착성의 호중구를 계산합니다.
  7. 혈소판 혈전 형성을 분석하고, "마스크"로 이동하여 "만들기"를 선택합니다.
  8. 마스크와 "현재 이미지에서"마크를 이름을 지정합니다.
  9. 기본보기에서 "움직이는 텍스트 도구"에서 "대형 연필 아이콘 '을 클릭합니다.
  10. 배경 마스크를 설정하는 기본보기에서 용기 외부 영역을 색상입니다.
  11. t로 이동O "마스크", "비행기를 복사", "현재 timepoint에 복사 마스크"를 클릭하고 "모든 timepoints"을 선택 클릭하고 "OK"를 클릭하십시오.
  12. 배경 신호를 계산하기 위해 '통계'로 이동 한 다음 "마스크 통계 '를 클릭합니다.
  13. 이미지 범위에서 "현재 2D 시간 경과 나 4D 이미지 (들)"을 클릭하고 마스크 범위에서 "전체 마스크"를 선택합니다. 캡처 날짜에서 "지역 (픽셀)"Morphometry 아래 강도에 따라 "최대 강도"를 선택 선택하고 "내보내기"(이 통계 방법을 누릅니다 우리가 수행 할 수 있습니다 기능에서 "경과 시간은 (: mm MS HH)"를 선택 자동 형광 강도를 (배경 신호)) 계산합니다.
  14. MS 오피스 Excel에서 텍스트 파일을 열고 녹음 기간 내내 배경 신호의 평균 값을 계산합니다. 이 배경 형광 강도입니다.
  15. 혈전 강도를 확인하려면 기본보기에서 "움직이는 텍스트 도구"에서 다시 "대형 연필 아이콘 '을 클릭합니다.
  16. 혈소판 신호를 설정하는 기본보기에서 용기 내부의 색상.
  17. '마스크'로 이동, "이 비행기를 복사합니다", "모든 timepoints"를 선택 "현재 timepoint에 복사 마스크"를 클릭하고 "확인"을 누릅니다.
  18. '통계'로 이동하여 '마스크 통계'를 클릭합니다.
  19. 이미지 범위에서 "현재 2D 시간 경과 나 4D 이미지 (들)"을 클릭하고 마스크 범위에서 "전체 마스크"를 선택합니다. 기능에서 선택 "경과 시간 (HH : MM : 밀리 초)"캡처 날짜에 따라, 우리에게 허용 "지역 (픽셀)"Morphometry 아래 강도에서 "합 강도"를 선택하고 "내보내기"(이 통계 방법을 클릭하고 ) 용기 내부의 형광 강도를 계산합니다.
  20. MS 오피스 엑셀에서 텍스트 파일을 엽니 다. 혈소판의 형광 신호는 용기의 내부의 합 강도의 배경 농도 X 지역의 평균 값 (픽셀)을 차감하여 계산됩니다. 이것은 혈소판 혈전의 형광 강도입니다.
  21. 3-5 다른 쥐 30 개 정맥에서이 작업을 반복합니다. 그런 다음, 혈소판의 형광 강도의 중간 값을 계산합니다.
  22. 에호중구 압연과 접착력을 분석, 호중구의 압연 유입는 각 세정맥에 5 분 이상 결정과 분 당 전화 번호로 제시했다. > 30 초 동안 정지했다 천천히 크롤링 (<10 μm 30 초)하지만 이월 안 자기편 호중구의 수는 계산하고 5 분마다 전화 번호로 제시했다.

5. 레이저 유도 Arteriolar 혈전증에 대한 Intravital 현미경

절제 레이저의 5-1 보정

  1. 현미경 단계에 미러링 된 슬라이드를 삽입, 슬라이드의 상단에 증류수의 작은 방울을 적용하고, 강도를 조정하고 접안 렌즈를 사용하여 초점을 맞 춥니 다.
  2. "초점 창"을 열고 SlideBook 5.0 소프트웨어의 'FRAP'탭을 선택합니다.
  3. 40-50에서 레이저 전원을 설정하고 모두 "더블 클릭 반복"과 "더블 클릭 크기"8로 설정합니다. 십자선의 설정을 가져 "가이드"상자에 표시합니다.
  4. 작업 표시 줄 O에서 '화살표'아이콘을 선택합니다N 화면 상단.
  5. "FRAP 정렬"탭에서 "다음 불"을 클릭하십시오. 작은 지점이 모니터의 왼쪽 하단 근처에 나타납니다. 그 자리가 표시되면 더블의 중심을 클릭합니다. 일단 클릭, 다른 장소 위 표시하고 첫 번째 지점의 오른쪽에해야한다, 그 위에 두 번 클릭합니다. 16 포인트 (16 일 현장의 오른쪽 하단 모서리에 나타납니다.) 보정 매개 변수를 업데이트 할 때 완료 "저장"을 클릭에 대해이 과정을 반복합니다.
  6. 교정의 정확성을 테스트하려면, 화면의 중앙에 나타납니다 "센터"버튼 - 작은 곳을 클릭합니다. 그렇지 않을 경우 원하는 정밀도가 달성 될 때까지 보정을 반복합니다.

5-2 레이저 유도 arteriolar 혈전 형성

  1. 현미경 단계에 anesthetized 마우스를 (2-2에 2-12의 절차를 참조) 놓습니다.
  2. "캡처"창에서 프로토콜을 선택하거나 새 계정을 만드십시오. 설정은 다음과 같습니다 CY5 (70 밀리 초 노출), 오픈 (10 MSEC 노출) 및 FITC (50 밀리 초 노출). 이미지가 20 분 (500 밀리 초의 간격 시간이 약 2400 시간 점)을 통해 캡처됩니다.
  3. Dylight 위에서 설명한 488-복합 항 마우스 CD42c와 알렉사 형석 647-복합 항 마우스 할머니-1 항체을 불러 일으킬.
  4. 로 3-7으로 3-3에 설명 된 형광 강도 밝은 현장 이미지를 포함하는 현미경 매개 변수를 최적화합니다.
  5. 적절한 brightfield 강도 또는 항체 신호, arteriole 게재 위치 및 초점을 보장하기 위해 "테스트"버튼을 클릭하십시오.
  6. 이미지 캡처 프로세스를 시작하려면 "시작"을 클릭합니다.
  7. 절제 레이저를 발사하기 전에 마우스 포인터 아이콘을 선택하고 혈관 벽이 명확한 초점에있는 것을되었는지 확인하십시오.
  8. 레이저를 발사하려면 두 번 혈관 벽 2-3 μm 내부적으로 장소를 클릭하십시오. arteriolar 내피 세포의 손상은 brightfield 이미지에 명백해야 시각적 인 형상 변화가 발생, 혈소판 축적이 나타납니다. 모니터 혈전레이저 부상 후 5 분에 형성.
  9. 레이저 부상 후 5 분 일시 정지 (혈전 크기가 지금은 안정적이어야합니다) 및 캡처를 취소합니다. 그 후, 20 분에 점착성의 혈소판 및 압연 / 점착성의 호중구를 기록 할 수있는 500 밀리 초 간격으로 2,400 시간을 포인트로 캡처를 시작합니다. 3 ~ 5 arterioles 한 마우스에 기록됩니다.
  10. 실험이 완료되면, 마우스는 자궁 경부 전위를 통해 euthanized되었다.

6. Arteriolar 혈전증 모델에 대한 데이터 분석

  1. 4.5 단계 4.1 이상 이동합니다.
  2. 혈소판 혈전 형성하는 동안 배경 형광 강도를 구하려면 4.14 단계 4.7 이상 이동합니다.
  3. '마스크'로 이동하여 '세그먼트', 채널의 선택 FITC을 클릭하고 낮은에 배경 신호의 평균 값을 삽입합니다. 클릭하면 "적용"및 "확인"을.
  4. 혈소판 혈전의 형광 강도 (Dylight 488-복합 항 CD42c 항체)를 분석하기 위해, 4.19 단계 4.18으로 이동합니다. 항체 신호를 계산하려면, "합 강도는"( "최대 강도"X "면적 (픽셀)") 배경 신호가 차감됩니다. 이것은 혈소판 혈전의 형광 강도입니다.
  5. 압연과 점착성의 호중구을 수량화하려면 timelapse을 재생하고 가시적 20 분에 걸쳐 혈소판 혈전 위에 마우스를 셀의 개수를 계산합니다. 최소한 2 초 동안 혈소판 혈전과 상호 작용하는 동안 롤링은 호중구 속도 감소로 정의됩니다. 점착성의 호중구은 적어도 2 분 동안 혈소판 혈전에 연결된 상태로 유지하는 호중구로 정의됩니다. 압연과 점착성의 호중구의 수는 20 분 당 전화 번호로 제시했다. 롤링 속도는 입자 추적 시스템을 사용하여 계산되었습니다.

결과

자세한 intravital 현미경 분석을 사용하여 활성화 된 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용은 혈소판 (CD42c) 또는 호중구 마커 (GR-1) 라이브 생쥐에 대한 휘황-라벨 항체의 주입으로 시각화했다.

TNF-α 유도 venular 염증 모델에서 대부분의 압연 호중구는 안정적으로 녹화 기간 (3-4.5 시간 TNF-α의 주입 후, 그림 2A 동안 ICAM-1 활성 β2 integrins의 상호 작용에 의해 아마 ?...

토론

여기 혈관 염증과 혈전증 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 실시간 형광 intravital 현미경에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이전 유사한 형광 현미경 방법은 혈전 형성과 혈관 염증의 분자 메커니즘을 연구보고되었다. 8,12가 heterotypic 세포 세포의 상호 작용은 부상 사이트에 vaso-가림을 위해 중요 할 수 있기 때문에,이 기술은를위한 가치있는 도구가...

공개

저자는 경쟁 금융이자를 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 작품은 건강의 국립 연구소에서 보조금 (JC에 P30 HL101302 및 RO1 HL109439)와 미국 심장 협회 (JC에 SDG 5270005)에 의해 부분적으로 지원되었다. A. Barazia은 T32HL007829 NIH 훈련 보조금에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClFisher Scientific7647-14-5
KClSigma-Aldrich7447-40-7
CaCl2 2H2OSigma-Aldrich10035-04-8
MgCl2 6H2OFisher Scientific7791-18-6
NaHCO3Fisher Scientific144-55-8
0.9% NaCl SalineHospira0409-4888-10
KetamineHospira0409-2051-05
XylazineLloyd
Intramedic Tubing (PE 90)BD Diagnostics427421
Intramedic Tubing (PE 10)BD Diagnostics427401
Murine TNF-αR&D Systems410-MT
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody Emfret AnalyticsX488
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) AntibodyBioLegend108418
NESLAB EX water bath/circulatorThermo-Scientific
Olympus BX61W microscopeOlympus
TH4-100 PowerOlympus
Lambda DG-4Sutter
MPC-200 multi-manipulatorSutter
R–-200 stage controllerSutter
C9300 high-speed cameraHamamatsu
IntensifierVideo Scope International
Ablation LaserPhotonic Instruments, Inc.
SlideBook 5.0Intelligent Imaging Innovations

참고문헌

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