In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio Attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Riepilogo

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

Abstract

Interazione delle piastrine attivate e leucociti neutrofili (principalmente) sulla trombosi attivato media endotelio e infiammazione vascolare. ^1,2 Durante la formazione del trombo nel sito di lesione arteriolare, piastrine aderenti all'endotelio attivato e proteine ​​della matrice subendoteliali supportare rotolamento dei neutrofili e adesione. ³ Viceversa, in venulare condizioni infiammatorie, aderenti neutrofili all'endotelio attivato può sostenere l'adesione e l'accumulo di piastrine circolanti. Eterotipica piastrine-neutrofili aggregazione richiede processi sequenziali dagli specifici recettori-counter interazioni tra cellule recettore. ⁴ È noto che cellule endoteliali attivate rilasciare molecole di adesione come fattore di von Willebrand, avviando adesione piastrinica e accumulo condizioni di alto shear. ⁵ Inoltre, cellule endoteliali attivate supportare rotolamento dei neutrofili e adesione da selectine esprimono unmolecola-1 di adesione intercellulare d (ICAM-1), rispettivamente, in condizioni di basso attrito. ⁴ piastrine P-selectina interagisce con neutrofili attraverso P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), inducendo così l'attivazione dei neutrofili β2 integrine e azienda adesione tra due tipi di cellule. Nonostante i progressi in esperimenti in vitro in cui sono determinati eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni in sangue intero o cellule isolate, ^6,7 quegli studi non può manipolare durante condizioni di stress ossidativo malattia vascolare. In questo rapporto, con marcati in fluorescenza, anticorpi specifici contro un mouse piastrinica e dei neutrofili marcatore, si descrive un dettagliato protocollo intravitale microscopica per monitorare le interazioni eterotipiche di piastrine e dei neutrofili sul endotelio attivato durante il TNF-α indotta da infiammazione o dopo laser-indotta lesioni in Cremaster microvasi muscolari di topi vivi.

Protocollo

1. Preparazione di Microscopio intravitale (Figura 1A)

1. Preparare tampone superfusione (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, e 17 mM NaHCO _3, pH 7,4).
2. Attivare un bagnomaria circolatorio per mantenere la temperatura del tampone e termo-controllata coperta a 37 ° C. Aerare tampone con gas di azoto _(5% di CO2 equilibrato con azoto).
3. Accendere il sistema di microscopio (Sutter Lambda DG-4 ad alta velocità di lunghezza d'onda cambia, postazione computer, microscopio Olympus BX61W, MPC-200 multi-manipolatore, ROE-200 fase, macchina fotografica ad alta velocità, e intensificatore).
4. Per il modello di infiammazione vascolare, usare uno specchio dicroico 100%. Di indurre la formazione di trombi da lesioni laser, sostituire uno specchio 100% con uno specchio 50/50% ed attivare un sistema di ablazione laser Micropoint.

2. Preparazione di Muscle Cremaster per microscopia intravitale (Figura 1B)

1. Anestetizzare untopo maschio (6-8 settimane di vita, C57BL / 6) mediante iniezione ip di ketamina (125 mg / kg di peso corporeo (BW)) e xilazina (12,5 mg / kg di peso corporeo). L'Università di cura degli animali e del Comitato Istituzionale Illinois Usa ha approvato tutte le cure degli animali e procedure sperimentali. Per un modello di infiammazione vascolare, iniettare murino TNF-α (0,5 mg in 250 microlitri salina) intrascrotally in un mouse 3 ore prima di imaging (2-2,5 ore prima dell'intervento).
2. Posizionare il mouse su una coperta termoregolata a 37 ° C su un vassoio intravitale microscopio.
3. Tirare verso l'alto la pelle sulla superficie del collo con pinze e incidere in senso orizzontale la linea mediana della pelle del collo fino a 1 cm con le forbici.
4. Aprire delicatamente il muscolo cervicale con le forbici smussate e rimuovere il muscolo che circonda la trachea.
5. Incannulare una PE90 tubo nella trachea per eliminare difficoltà di respirazione.
6. Rimuovere delicatamente il lato sinistro del muscolo cervicale e isolare la vena giugulare dai tessuti circostanti.
7. C annutardi un tubo PE10 nella vena giugulare sinistra per l'infusione di anticorpi e anestetici aggiuntivi.
8. Estrarre delicatamente e incidere la pelle dello scroto in senso orizzontale. Per mantenere l'integrità del tessuto durante l'esperimento, tampone preriscaldato stato superfuse sul campo chirurgico.
9. Premere sul basso addome con una pinza ed estrarre delicatamente un testicolo con l'altra pinza.
10. Rimuovere i tessuti circostanti connettivo di tutto il testicolo.
11. Incidere il muscolo cremastere verticale e appiattire il muscolo su un vetrino di vetro su un vassoio microscopio intravitale da appuntare la periferia.
12. Lasciare 10-20 minuti per il muscolo si stabilizzi prima della raccolta dei dati. Arteriole muscolari Cremaster (per la formazione del trombo) e venule (per infiammazione vascolare) con un diametro di 30-45 micron sono stati scelti per il nostro studio.
13. Per mantenere condizioni anestetiche, infondere 30-50 ml dello stesso anestetico circa ogni 30 min attraverso il cannulus giugulare.

3. Microscopia intravitale per TNF-α indotta infiammazione vascolare

1. Dopo il posizionamento del mouse sul microscopio intravitale, aperto SlideBook software 5.0 e fare clic su "Finestra di messa a fuoco" nella barra dei menu per impostare l'ottica adeguati e oggettivi (60X).
2. Infondere Dylight 488-coniugato anti-topo ratto CD42c (0,1 mcg / g BW in 100 microlitri soluzione salina) e Alexa Fluor 647-coniugati ratto anti-topo Gr-1 anticorpi (0,05 mg / g BW in 100 microlitri soluzione salina) attraverso un cannulus giugulare .
3. Vai alla barra dei menu, e fare clic su "Cattura immagine" nella barra degli strumenti.
4. Un nuovo menu pop-up; In "Image", selezionare "Bin Factor" come 1x1 e selezionare "640" sulla larghezza e "460" in altezza.
5. In "Imposta Filtro", contrassegnare la casella di controllo per i canali che si desidera esporre e impostare il tempo di esposizione per ogni. Ad esempio, canale aperto: 10 msec, FITC canale: 50 msec, e Cy5 canale: 50 msec.
6. Selezionare "Time-Lapse Capture" per regolare il numero di punti di tempo e l'intervallo. For il modello di infiammazione, il numero di punti temporali è impostata 1000-1500 con un intervallo di 200 msec (Tempo totale: 5 min).
7. Fare clic su "Test" per vedere un singolo piano dell'immagine al tempo di esposizione specificato per quel canale. Regolare il tempo di esposizione e / o la luce del microscopio fino a quando l'istogramma mostra una distribuzione adeguata intensità (per multi-canale di acquisizione, ripetere questo processo per ogni canale).
8. Una volta che tutti i parametri sono impostati (canali, tempi di esposizione, e così via) in "Cattura immagine", selezionare "Start" per avviare l'acquisizione.
9. Monitorare piastrine di laminazione e aderente e neutrofili per 5 minuti nella metà superiore di un venule cremastere infiammata nel modello di infiammazione vascolare. Da otto a dieci venule sono registrati in un topo.
10. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento totale di 60X (1,0 obiettivo NA acqua ad immersione), dando una dimensione della finestra di 157 micron x 118 micron.
11. Al termine dell'esperimento, i topi sono stati sacrificati tramite cervicale dislocation.

4. Analisi dei dati per il modello Infiammazione venulare

1. Aprire SlideBook software 5.0 e fare clic su "Cartella" nella barra dei menu per aprire un file.
2. Fare clic sul menu a discesa e selezionate "Apri, FITC, Cy5, ecc"
3. Fare clic su "Renormalize (barre rosse e verdi)" e selezionare il canale. Trascinare le barre rosse e verdi a sinistra oa destra per ottimizzare o meno il segnale di fluorescenza.
4. Fare clic su "Applica" e "OK" per aggiornare l'immagine.
5. Fare clic su "Pulsante Miniatura" per selezionare la visualizzazione corrente come predefinito.
6. Gioca immagine Timelapse catturata, e contare neutrofili laminazione e aderente durante il periodo di 5 minuti.
7. Per analizzare piastrine formazione di trombi, andare a "Mask" e selezionare "Crea".
8. Il nome di una maschera e marchio "Nell'immagine corrente".
9. Fare clic su "icona grande matita" in "Tool Marquee" nella vista principale.
10. Il colore di una regione al di fuori della nave nella vista principale per impostare una maschera di sfondo.
11. Vai to "Maschera", fare clic su "Copia This Plane", fare clic su "Copia in maschera timepoint corrente" e selezionare "Tutti i riferimenti temporali", e fare clic su "OK".
12. Per calcolare segnale di fondo, andare su "Statistiche" e fare clic su "Statistiche Mask".
13. Fare clic su "Current Time lapse 2D o 4D Image (s)" in Scope, e selezionare "intera maschera" in ambito Mask. In Funzioni, selezionare "Tempo trascorso (hh: mm: ms)" sotto data di cattura, selezionare "Area (pixel)" sotto morfometria, selezionare "Potenza massima" sotto intensità, e fare clic su "Esporta" (Questo metodo ci permette di statistica calcolo automatico intensità di fluorescenza (segnale di fondo)).
14. Aprire il file di testo in MS Office Excel e calcolare il valore medio del segnale di fondo per tutto il periodo di registrazione. Questo è l'intensità di fluorescenza di sfondo.
15. Per determinare l'intensità del trombo, fare clic su "icona grande matita" di nuovo in "strumento Marquee" nella vista principale.
16. Colore all'interno della nave nella vista principale per impostare il segnale delle piastrine.
17. Vai su "Mask", fare clic su "Copia This Plane", fare clic su "Copia in maschera timepoint corrente", selezionare "tutte le visite", e fare clic su "OK".
18. Vai su "Statistiche" e fare clic su "Statistiche Mask".
19. Fare clic su "Current Time lapse 2D o 4D Image (s)" in Scope, e selezionare "intera maschera" in ambito Mask. In Funzioni, selezionare "Tempo trascorso (hh: mm: ms)" sotto data di cattura, selezionare "Area (pixel)" sotto morfometria, selezionare "Potenza Sum" sotto intensità, e fare clic su "Esporta" (Questo metodo ci permette di statistica calcolare l'intensità di fluorescenza all'interno del recipiente).
20. Aprire il file di testo in Microsoft Office Excel. Segnale di fluorescenza di piastrine viene calcolato sottraendo il valore medio di intensità Area sfondo x (pixel) dalla somma di intensità della parte interna del vaso. Questo è l'intensità di fluorescenza del trombo di piastrine.
21. Ripetere questo in 30 diversi venule in 3-5 diversi tipi di mouse. Quindi, calcola il valore medio della intensità di fluorescenza delle piastrine.
22. Aanalizzare il rotolamento dei neutrofili e l'adesione, l'afflusso di rotolamento dei neutrofili è stata determinata oltre 5 min in ciascuna venule e presentati come numero di cellule al minuto. Il numero di neutrofili aderenti che sono stati fermi per> 30 sec e lentamente strisciando (<10 micron più di 30 secondi), ma non rotolare, sono stati contati e presentati come numero di cellule per 5 min.

5. Microscopia intravitale per Laser-indotta trombosi arteriolare

5-1 Calibrazione di ablazione laser

1. Inserire una diapositiva a specchio sul palco microscopio, applicare una piccola goccia di acqua distillata fino alla parte superiore della diapositiva, e regolare l'intensità e mettere a fuoco con l'oculare.
2. Aprire "Finestra di messa a fuoco" e selezionare la scheda "FRAP" nel software SlideBook 5.0.
3. Impostare la potenza del laser a 40-50, e impostare entrambe le "ripetizioni Fare doppio clic su" e "dimensione Doppio click" a 8. Segnare la casella "Guida" per far apparire una serie di mirini.
4. Selezionare l'icona "Freccia" dalla barra delle applicazioni on parte superiore dello schermo.
5. Nella sezione "Allineamento FRAP" scheda, fare clic su "Fuoco prossimo". Un piccolo punto dovrebbe apparire vicino all'angolo in basso a sinistra sul monitor. Una volta che il punto viene visualizzata, fare doppio clic sul centro di esso. Una volta cliccato, un altro punto dovrebbe apparire in alto a destra del primo spot, fare doppio clic su di esso. Ripetere questa operazione per 16 punti (16 ^° posto apparirà nell'angolo in basso a destra.) Fare clic su "Salva" quando completo per aggiornare i parametri di calibrazione.
6. Per verificare la precisione della calibrazione, fare clic sul pulsante, un "Centro" piccolo punto dovrebbe apparire al centro dello schermo. In caso contrario, ripetere la calibrazione fino a quando la precisione desiderata.

5-2 laser-indotta la formazione di trombi arteriolare

1. Inserire un mouse anestetizzato (vedere la procedura di 2-2 a 2-12) sul palco microscopio.
2. Sotto la finestra "Capture", selezionare un protocollo o di crearne uno nuovo. Le impostazioni sono le seguenti: CY5 (70 esposizione msec), Open (10 mseesposizione c), e FITC (50 esposizione msec). L'immagine è catturata più di 20 minuti (circa 2.400 punti di tempo con un intervallo di tempo di 500 msec).
3. Infondere Dylight 488-coniugato anti-topo CD42c e Alexa Fluor 647-coniugato anti-topo Gr-1 anticorpi come descritto sopra.
4. Ottimizzare i parametri microscopio tra intensità di fluorescenza e di immagine in campo chiaro come descritto in 3-3 per 3-7.
5. Fare clic sul pulsante "Test" per garantire la giusta intensità campo chiaro o segnale anticorpo, arteriola posizionamento e messa a fuoco.
6. Fare clic su "Start" per avviare il processo di cattura dell'immagine.
7. Prima di sparare il laser ablazione, accertarsi che l'icona del puntatore del mouse è stato selezionato e che la parete del vaso è a fuoco chiaro.
8. Per sparare il laser, fare doppio clic su un punto 2-3 micron internamente dalla parete del serbatoio. Lesioni delle cellule endoteliali arteriolare provoca un cambiamento visivo forma che dovrebbe essere evidente nell'immagine chiaro, seguito da accumulo piastrinica. Monitor tromboformazione per 5 min dopo la lesione laser.
9. Cinque minuti dopo la lesione laser (la dimensione del trombo dovrebbe essere stabile) mettere in pausa e annullare la cattura. Successivamente, avviare una cattura con 2400 punti di tempo con un intervallo di 500 msec per registrare piastrine aderenti e neutrofili laminazione / aderente per 20 min. Da tre a cinque arteriole sono registrati in un mouse.
10. Al termine dell'esperimento, i topi sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale.

6. Analisi dei dati per il modello Trombosi arteriolare

1. Andare oltre 4,1 passi attraverso 4.5.
2. Per ottenere l'intensità di fluorescenza di fondo durante le piastrine formazione di trombi, andare oltre i passaggi attraverso 4,7 4.14.
3. Vai su "Mask", fare clic su "Segmento", selezionare FITC nel canale, e inserire il valore medio del segnale di fondo su Low. Fare clic su "Applica" e "OK".
4. Per analizzare l'intensità di fluorescenza del trombo di piastrine (Dylight 488-coniugato anticorpo anti-CD42c), andare oltre 4,18 passaggi attraverso 4.19. Per calcolare il segnale anticorpo, "Intensity Somma" viene sottratto dal segnale di fondo ("Maximum Intensity" x "Area (pixel)"). Questo è l'intensità di fluorescenza del trombo di piastrine.
5. Per quantificare i neutrofili di laminazione e aderente, giocare il timelapse e contare il numero di celle che visibilmente rotolano nei trombi piastrinici oltre 20 min. Rotolamento è definita come una diminuzione della velocità neutrofili mentre interagisce con il trombo di piastrine per almeno 2 sec. Neutrofili aderenti si intende qualsiasi neutrofili che rimangono attaccati ai trombi piastrinici per almeno 2 min. Il numero di neutrofili laminazione e aderente è stato presentato come il numero di cellule per 20 min. Velocità di laminazione è stata calcolata usando un sistema di tracciamento di particelle.

Risultati

Con un'analisi dettagliata microscopia intravitale, eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato sono state visualizzate mediante infusione di anticorpi marcati con fluorescenza contro una piastrina (CD42c) o neutrofili marcatore (Gr-1) in topi vivi.

In un modello di TNF-α indotta infiammazione venulare, neutrofili più laminazione sono stabilmente aderito all'endotelio presumibilmente dall'interazione attivati ​​β2 integrine con ICAM-1 durante il pe...

Discussione

Qui si descrive un protocollo dettagliato per tempo reale microscopia a fluorescenza intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio vascolare attivato durante l'infiammazione e trombosi. In precedenza, simili approcci fluorescenza microscopiche sono stati segnalati per studiare il meccanismo molecolare della formazione di trombi e infiammazione vascolare. ^8,12 Poiché il heterotypic interazione cellula-cellula potrebbe essere importante per vaso-occlusione al ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	10035-04-8
MgCl2 6H2O	Fisher Scientific	7791-18-6
NaHCO3	Fisher Scientific	144-55-8
0.9% NaCl Saline	Hospira	0409-4888-10
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine	Lloyd
Intramedic Tubing (PE 90)	BD Diagnostics	427421
Intramedic Tubing (PE 10)	BD Diagnostics	427401
Murine TNF-α	R&D Systems	410-MT
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody	Emfret Analytics	X488
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody	BioLegend	108418
NESLAB EX water bath/circulator	Thermo-Scientific
Olympus BX61W microscope	Olympus
TH4-100 Power	Olympus
Lambda DG-4	Sutter
MPC-200 multi-manipulator	Sutter
R–-200 stage controller	Sutter
C9300 high-speed camera	Hamamatsu
Intensifier	Video Scope International
Ablation Laser	Photonic Instruments, Inc.
SlideBook 5.0	Intelligent Imaging Innovations