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Radical baseado em química biomimética tem sido aplicado para a construção de bibliotecas, necessários para o desenvolvimento de biomarcadores.
O envolvimento dos radicais livres em ciências da vida tem aumentado constantemente ao longo do tempo e tem sido ligado a vários processos fisiológicos e patológicos. Este assunto abrange diversas áreas científicas, abrangendo desde a química, física, biológica e bioorganic para a biologia e medicina, com aplicações para a melhoria da qualidade de vida, saúde e envelhecimento. Competências multidisciplinares são necessários para a investigação completa das várias facetas do processo radicais no ambiente biológico e químico conhecimento desempenha um papel crucial em revelar processos básicos e mecanismos. Nós desenvolvemos uma abordagem de biologia química capaz de se conectar a reatividade química de radicais livres com processos biológicos, fornecendo informações sobre as rotas mecanísticas e produtos. O núcleo da presente abordagem é a concepção de modelos biomiméticos para estudar o comportamento de biomoléculas (lípidos, ácidos nucleicos e proteínas) em sistemas aquosos, obtendo insights da reacção das vias, bem como ums construção de bibliotecas moleculares dos produtos livres de reação radical. Neste contexto, pode ser utilizada com sucesso para a descoberta de biomarcadores e exemplos são fornecidos com duas classes de compostos: mono-trans isómeros de ésteres de colesterol, que são sintetizados e utilizados como referência para a detecção em plasma humano, e de purinas 5 ',8-ciclo-2 '-desoxiribonucleósidos, preparados e utilizados como referência no protocolo para a detecção de lesões em amostras de DNA, depois de radiações ionizantes ou obtidos a partir de diferentes condições de saúde.
A reatividade de radicais livres revelou sua enorme importância para muitos eventos biológicos, incluindo o envelhecimento e inflamação. Hoje em dia, é cada vez mais evidente que a clarificação de cada passo químico envolvido nesta reactividade é necessário, de forma a compreender os mecanismos subjacentes e estratégias prevêem eficazes para o controlo de radicais livres e de reparação dos danos. A contribuição dos estudos químicos é fundamental, mas o estudo direto no ambiente biológico pode ser difícil, uma vez que a sobreposição de diferentes processos complica e perturba a análise dos resultados e as conclusões relacionadas. Assim, a estratégia de modelação reacções de radicais livres em condições biologicamente relacionados tornou-se um passo fundamental na investigação de mecanismos químicos em biologia.
Na última década, o nosso grupo desenvolveu modelos de processos do radical livre sob condições biomiméticos. Em particular, PTvisaged transformações biologicamente relevantes de ácidos graxos insaturados, nucleosídeos e enxofre contendo aminoácidos e colocá-los no caminho certo para ser avaliado e validado como biomarcadores do estado de saúde 1-4.
Nossa abordagem geral consiste de três módulos:
Nós escolhemos duas classes de biomarcadores para acreditar nesta abordagem: ésteres de colesterilo e de purinas 5 ',8-ciclo-2'-desoxiribonucleósidos.
1. Síntese de Mono-trans de ésteres de colesterilo
2. Isolamento da fracção éster de colesterol a partir de soro humano
3. Caracterização de Mono-trans ésteres de colesterilo por Espectroscopia Raman
4. A derivatização de ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) e análise por cromatografia gasosa acoplada
5. Síntese de (5'R) - e (5'S) -5 ', 8-ciclo-2'-desoxiadenosina
6. Síntese de (5'R) - umd (5'S) -5 ', 8-ciclo-2'-desoxiguanosina
7. Síntese de purina Labeled isotópica (5'R) - e (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides
8. Radiólise gama de soluções de DNA aquosas
9. Digestão enzimática de DNA
10. Dessalinização DNA da amostra antes da análise
11. Análise Quantitativa LC-MS/MS
O processo de isomerização foi descrito em particular para os ésteres de colesterilo que proporcionem as mono-isómeros trans de ácidos linoleico e araquidónico, mostrados na Figura 1, tal como os primeiros produtos deste ataque, que podem ocorrer em condições de stress de radicais livres no meio biológico. 5
Na Figura 3, o mecanismo de química envolvida na ligação a isomerização cis-trans dupla é mostrado. A fonte radical é indicado de forma genérica para pagar S centradas radicais. Nos protocolos descritos a fonte de radical é a luz UV, que é capaz de quebrar a ligação presente homolitically SH na molécula de tiol RSH.
A Figura 4 resume os três passos de protocolo para a síntese da classe de lípidos modificados e sua detecção no plasma humano: a síntese representa um processo livre biomimética radical e também fornece uma entrada de uma panela conveniente para o Geometisómeros rical, sem qualquer contaminação por isómeros posicionais seguido de protocolos de purificação e isolamento.
Várias metodologias de análise pode ser aplicado para uma detecção de alta sensibilidade do teor de isómero trans e caracterização da biblioteca de éster mono-trans colesterilo. Em particular, a espectroscopia de Raman pode ser realizada directamente sobre a fracção de éster de colesterol sem derivação (ver Figura 2 e Figura 9).
O segundo exemplo refere-purina 5 ',8-ciclo-2'-desoxiribonucleósidos, que são lesões do ADN criadas pelo ataque de radicais livres na posição C5 'da porção açúcar e subsequente formação de uma ligação covalente entre o açúcar e a base porções. Quatro estruturas podem ser produzidas, ou seja, 5 ', 8-ciclo-2'-desoxiadenosina e 5 ', 8-ciclo-2'-desoxiguanosina, ambos existentes nos 5'R e 5'S formas diastereoméricas (Figura 5). Na Figura 6 tele mecanismo de reacção é mostrado, que envolve a fotólise de 8-bromopurina derivados 5 para dar os correspondentes radical C8 6, que abstrai intramolecularmente um átomo de hidrogénio a partir da posição C5 'selectivamente para se obter o 7-2'-5'-deoxyadenosin ilo. 7 radical sofre ciclização com uma velocidade constante no intervalo de 10 5 -10 6 s-1, 2, seguido de oxidação do radical heteroaromático de 8 para dar os produtos finais 9. A reacção dos radicais hidroxilo, gerado por radiólise da água, com 2'-desoxiadenosina 2'-desoxiguanosina e (10) foi encontrada para ocorrer ca. 10% por abstração de hidrogênio a partir da posição C5 ". 7
A nossa abordagem biologia química para as bibliotecas de purina 5 ',8-ciclo-2'-desoxiribonucleósidos (incluindo compostos marcados) é ilustrada na Figura 7, com a identificação dessas lesões nos oligonucleótidos, bem como em amostras de DNA obtidas a partir de various fontes, tais como, por exemplo, tratada sob condições de radiação ionizante, como mímica das condições de stress radicais.
Na figura 8 um equipamento fotorreator típico é mostrado. O dispositivo permite a irradiação de compostos dissolvidos no solvente apropriado. É constituída por: i) a câmara de reacção equipado com a entrada para o gás inerte (na parte inferior) e duas entradas para a saída do gás e para a adição de reagentes, ii) uma câmara interna que contém a lâmpada de mercúrio ligado a um adequado sistema de refrigeração e de energia eléctrica, que é inserido para dentro da câmara de reacção através de uma junta de vidro.
Figura 1. Mono-trans de colesterilo e linoleato de araquidonato.
Figura 2. Ésteres de colesterol na análise de soro e humana direta para mono-trans por espectroscopia Raman.
Figura 3. O processo de adição-eliminação, que leva à isomerização cis-trans de ligações duplas por radicais thiyl.
Figura 4. Três passos para o desenvolvimento do protocolo de ésteres mono-trans colesterol como biomarcador de estresse dos radicais livres.
Figura 5. A purina quatro 5 ',8-ciclo-2'-desoxiribonucleósidos diastereoisómeros. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 6. Geração de C5 'radicais, ou por fotólise de 5 ou de 10 por reacção com os radicais HO •, e o mecanismo de purina 5' ,8-ciclo-2 'formação desoxinbonucleosido. para ver figura maior .
Figura 7. Protocolo fou a identificação de algumas lesões radical à base de ADN; mtDNA: DNA mitocondrial, nDNA: DNA nuclear.
Figura 8. Reator fotoquímico.
Figura 9. Espectro de Raman representativo de plasma de ésteres de colesterilo. Na comparação da inserção de uma região específica de colesteril com o linoleato de colesterilo e mono-trans de ácido linoleico.
Figura 10. Representante análise GC de FAME obtida a partir de ésteres de colesterilo no plasma.
Figura 11. Representante HPLC executar contendo 2'-desoxiadenosina e 2'desoxiguanosina juntamente com a sua oxidativo e purina 5 ',8-ciclo-2'-Deoxyribo nucleosídeos. Clique aqui para ver maior figura .
A conversão de ocorrência natural de ácidos gordos insaturados cis para trans isómeros geométricos é uma transformação relacionada com a produção de stress radical no ambiente biológico. Lipidos da membrana celular, que contêm os ácidos gordos, é um alvo relevante para o stress biológico e radical que primeiro estudou a endógeno isomerização cis-trans fosfolípidos em culturas de células, animais e seres humanos que avaliam protocolos analíticos em cada caso. 8-10 Foi demonstrado que esta transformação pode ocorrer através de uma variedade de compostos contendo S, incluindo tióis, tioéteres e dissulfetos, que, sob diferentes condições de stress radicais são capazes de gerar radicais thiyl, ou seja, o agente de isomerização (Figura 3). O exemplo mostrado no artigo centra-se na classe de ésteres de colesterilo, que representam uma fracção muito conhecido de lípidos no plasma, estritamente envolvido no metabolismo das lipoproteínas. A ligação éster entre os ácidos gordos e chorol é biossintetizado pela transferência de ácidos gordos a partir da posição 2 da porção de glicerol de fosfatidil de colesterol, um passo catalisado pela enzima acil lecitina colesterol transferase (LCAT). Por isso, os ésteres de colesterol no plasma são estritamente relacionado com o volume de negócios lipídica da membrana, e contêm proporções relativamente elevadas dos ácidos gordos poli-insaturados (PUFA), tipicamente presentes em fosfatidilcolinas, isto é, linoleico e os ácidos araquidónico. Formação de lipoproteínas está envolvido em doenças cardiovasculares e metabólicas. A reactividade de ésteres de colesterilo naturais com os radicais livres podem ocorrer nas ligações duplas de linoleato e resíduos de ácido araquidônico, que podem ser transformados nos correspondentes isómeros geométricos trans (ver Figura 1 para as estruturas). Caracterização do teor de éster de colesterilo trans em amostras biológicas é interessante para o desenvolvimento de biomarcadores. Uma metodologia indirecta consiste na transformação de cholesteryésteres de l, isolada de plasma para os correspondentes ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) e separação por protocolos cromatográficos de gás. Neste caso, a calibração das referências normalizadas de cis e trans de ésteres metílicos de ácidos gordos é executada, a fim de permitir a quantificação do teor de trans nas amostras. Com base nos estudos analíticos realizados sobre a biblioteca de éster de colesterilo, propôs-se aplicar também um método baseado na espectroscopia de Raman, que pode ser realizada directamente sobre a fracção de ésteres de colesterilo, isolada de plasma, sem derivatização após a FAME correspondente (ver Figuras 2 e 9). É interessante notar que até agora não existem métodos de sucesso são descritos para cis separado e isômeros trans de ácidos graxos contendo lipídios por HPLC, em vez como descrito por hidroperóxidos de éster de colesterol. Até agora, o método de cromatografia de gás indireta ainda é o melhor método disponível até agora. Por este método o primeiro quantitativa avação do conteúdo mono-trans a partir de ésteres de colesterol derivado isolado a partir de plasma de indivíduos saudáveis foram fornecidas. Usando Detector de Ionização de Chama (FID) do limite de detectabilidade é satisfatório (ppb) e as quantidades nanomolares dos compostos foram detectados. 5. Com sistemas de detecção de diferentes este limite pode ser ainda reduzido. O efeito da radiação ionizante em ésteres de colesterol é matéria de estudos adicionais, se uma resposta linear é obtido em relação à dose aplicada.
Como um segundo exemplo, escolhemos nucleósidos modificados que podem ser produzidos por radicais livres danos de DNA. Os radicais hidroxilo (HO •) são conhecidos por serem os mais prejudiciais Espécies reactivas de oxigénio (ROS) para a sua capacidade para causar modificações químicas de DNA. Lesões simples ou múltiplas podem ocorrer no DNA, que, em células eucarióticas está localizado no núcleo e as mitocôndrias. Identificação e medição das principais classes de oxidativos danos gerados ao DNA requerem o adequado doiate bibliotecas moleculares, a fim de definir os protocolos analíticos. Focamos nosso interesse sobre as lesões mais pequenas em tandem, os quais são purinas 5 ',8-ciclo-2'-desoxiribonucleósidos, tendo uma ligação covalente adicional entre a base e as porções de açúcar criadas pelo ataque de radicais livres. Os compostos são 5 ',8-ciclo-2'-desoxiadenosina e 5 ', 8-ciclo-2'-desoxiguanosina existente nos 5'R e 5'S formas diastereoméricas (Figura 5). O seu potencial para se tornar marcador de stress de radicais livres é a matéria de investigação fundamental. 2 Com efeito, quando o DNA é exposto a HO • abstração radical hidrogénio a partir da posição C5 'do açúcar é um dos possíveis eventos que conduzem à formação destas lesões em tandem. Purina 5 ',8-cyclonucleosides pode ser medido como a soma de diastereómeros por HPLC-MS/MS enzimaticamente digeridas em amostras irradiadas γ ADN variando 1-12 lesões / 10 6 nucleósidos / Gy indo ausência forma de oxigénio ao nível fisiológico de oxigénio Eutecidos n, a proporção diastereomérica 5'R / 5'S sendo ~ ~ 4 e 3 para 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdGuo, respectivamente (Figura 11). 11 É interessante notar que a relação entre a dose de radiação e 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdAdo lesões detectadas no ADN celular está longe de serem compreendidos. O experimento único baseado irradiação 2kGy relatado na experimental não podem ser considerados conclusivos. 11 Outras experiências deste tipo e quantificação do método dos quatro lesões são necessários para definir tais relações. A detecção destas lesões e as transformações oxidativas mais populares (tais como 8-oxo-2 '-desoxiguanosina, 8-oxodGuo) são assunto de investigações intensas, evidenciando a importância de ambas as lesões durante o metabolismo oxidativo. 6,13 O uso de HPLC -MS/MS (quadrupolo triplo) tem um limite de detecção de cerca de 30fmol para todos os quatro lesões. Melhorias últimos são requeridas para alcançar limites de detecção dos níveis attomol pela produ instrumentoRCEs. Com base na literatura recente, 6 procedimentos analíticos têm de incluir a limpeza adequada da amostra e o enriquecimento, a fim de satisfazer os limites de detecção da MS / MS / MS (armadilha de iões) ou da MS / MS (quadrupolo triplo) usado no nosso caso.
Bio-inspirados procedimentos de síntese de compostos 1-4 foram desenvolvidas a partir da 8-bromopurina derivados segundo ou fotólise. 7,12 Estes procedimentos envolvem a reacção em cascata radical que imita o mecanismo de dano do ADN de formação de 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdGuo lesões. A partir de perspectivas biológicas, verificou-se que estas lesões se acumulam com o envelhecimento de um modo específico do tecido (fígado> rim cérebro>), fornecendo a evidência de que os mecanismos de reparação de ADN são inadequadas para preservar o material genético a partir de tais lesões. 13 Com efeito, a reparação de excisão de nucleótidos (NER) é o único caminho actualmente identificados para a reparação das lesões. 2
A classe doises de compostos mostrados nas Figuras 1 e 5 não estão comercialmente disponíveis no momento, no entanto, por as estratégias de síntese descritos na literatura, não seria difícil de preparar estes compostos para uso comercial.
A abordagem multidisciplinar fornecida por estudos de biologia química não só tem um enorme valor para a identificação de novos mecanismos que ocorrem no ambiente biológico, mas também dá um contributo fundamental para a descoberta de biomarcadores e diagnóstico, em última análise, trazendo novidade em cuidados de saúde e estratégias de prevenção. 14 A contribuição química é necessária para um bom desenvolvimento da medicina molecular, criando plataformas integradas e painéis para perfis metabólicos, que se prevê venham a permitir uma óptima racionalização do desenho da intervenção, quer terapêutica e nutricional, reduzir as incertezas e falhas quando podem ser previsíveis.
Não há conflitos de interesse declarados.
O apoio financeiro da dell'Istruzione Ministero, della Ricerca dell'Universita (PRIN-2009K3RH7N_002) e Marie Curie Fellowship intra-europeu (CYCLOGUO-298555), bem como o patrocínio da Acção COST CM0603 em "Radicais Livres em Biologia Química e Acção COST CM1201 em "Química Biomimetic Radical" Agradecemos imensamente.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MATERIALS | |||
Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
8-Bromo-2'-deoxyguanosine | Berry Associates | PR3290-1 g | |
8-Bromo-2'-deoxyadenosine | Berry Associates | PR3300-1 g | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
EQUIPMENT | |||
60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 |
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