Teste de suscetibilidade de antibiótico induzido por estresse em um chip

Resumo

Desenvolvemos uma plataforma microfluidica para testes rápidos de suscetibilidade a antibióticos. O fluido é passado em altas velocidades sobre bactérias imobilizadas na parte inferior de um canal microfluido. Na presença de estresse e antibiótico, cepas suscetíveis de bactérias morrem rapidamente. No entanto, bactérias resistentes podem sobreviver a essas condições estressantes.

Resumo

Desenvolvemos um método microfluido rápido para testes de suscetibilidade a antibióticos em um ambiente baseado em estresse. O fluido é passado em altas velocidades sobre bactérias imobilizadas na parte inferior de um canal microfluido. Na presença de estresse e antibiótico, cepas suscetíveis de bactérias morrem rapidamente. No entanto, bactérias resistentes sobrevivem a essas condições estressantes. A hipótese por trás desse método é nova: a ativação do estresse das vias bioquímicas, que são alvos de antibióticos, pode acelerar os testes de suscetibilidade a antibióticos. Em comparação com os métodos padrão de teste de suscetibilidade a antibióticos, a etapa limitante da taxa - crescimento bacteriano - é omitida durante a aplicação de antibióticos. A implementação técnica do método está em uma combinação de técnicas padrão e abordagens inovadoras. As partes padrão do método incluem protocolos de cultura bacteriana, definição de canais microfluidos em polidimtilsiloxano (PDMS), monitoramento de viabilidade celular com fluorescência e processamento de imagens em lote para contagem de bactérias. Partes inovadoras do método estão no uso do fluxo de mídia cultural para aplicação de estresse mecânico, uso de enzimas para danificar, mas não matar as bactérias, e uso de substratos de microarray para apego bacteriano. A plataforma desenvolvida pode ser usada no desenvolvimento e teste de medicamentos não anticóticos e antibióticos. Em comparação com os experimentos padrão de suspensão bacteriana, o efeito da droga pode ser ligado e desligado repetidamente durante períodos de tempo controlados. A observação repetitiva da mesma população bacteriana é possível ao longo do mesmo experimento.

Introdução

O aumento da resistência bacteriana intensifica a necessidade de testes rápidos de suscetibilidade a antibióticos à base de fenótipo, a fim de proteger nossos medicamentos de último recurso. Os testes de suscetibilidade padrão são baseados na inibição do crescimento bacteriano na presença de antibióticos que levam várias (8-24) horas para serem concluídos. Desenvolvemos um novo teste de suscetibilidade a antibióticos em uma plataforma microfluidica que conta com a ativação do estresse de vias biossintéticas para acelerar a ação de antibióticos.

Os testes de suscetibilidade a antibióticos na escala microfluidic carregam a vantagem do uso efetivo da amostra, uma vez que requerem um pequeno número de bactérias. Além disso, dispositivos microfluidos podem ser multiplexados para testar várias amostras em múltiplas condições^1,2. Recentemente, uma série de métodos microfluídicos para testes de suscetibilidade a antibióticos foram relatados^3-9. Nesses métodos, as bactérias são cultivadas dentro de gotículas nano e picoliter^3,7, no volume total do canal microfluido^4-6,8, ou como bactérias únicas eletricamente localizadas à superfície inferior do canal⁹. Embora esses testes sejam realizados em canais microfluidos, todos monitoram o crescimento microbiano na presença e ausência de antibióticos semelhantes aos métodos tradicionais. As medidas de crescimento são tomadas através de densidade óptica, corantes sensíveis ao pH ou imagens de contraste/fase brilhantes ou imagens de fluorescência. Embora alguns desses testes sejam mais rápidos do que os métodos tradicionais, cada um detecta passivamente resistência a antibióticos. Em outras palavras, esses métodos ainda exigem que o usuário aguarde o crescimento bacteriano como a leitura final.

Em contraste, desenvolvemos um método que usa uma combinação de tesoura e estresse enzimático para ativar vias bioquímicas sensíveis a antibióticos¹⁰. Desafiar as bactérias estressadas com esses antibióticos cria um teste de suscetibilidade mais rápido. Bactérias resistentes ao antibiótico são capazes de suportar as condições estressantes. Bactérias suscetíveis, por outro lado, são rapidamente mortas pelas tensões combinadas. A porcentagem de morte celular após uma hora, medida por microscopia usando uma mancha de célula morta fluorescente, define o fenótipo da bactéria (resistente versus suscetível).

Para uma implementação bem sucedida do nosso método, as bactérias devem ser imobilizadas na superfície inferior do canal microfluido. Desta forma, as bactérias podem ser submetidas a várias tensões e simultaneamente imagens sob um microscópio em um único plano. Uma lâmina de vidro de microscópio revestida é usada para imobilização de bactérias. O slide é pré-revestido pelo fabricante com grupos de epóxi para ligação proteica não específica. A ligação inespecífica desses epóxis às proteínas da superfície bacteriana prende covalentemente as bactérias à superfície da lâmina.

As cepas são testadas em condições idênticas (tesoura + estresse enzimático) na ausência (controle) e presença (experimento) de antibiótico. O contraste de fase e as imagens do microscópio de fluorescência de cada canal são tiradas automaticamente a cada dois minutos durante uma hora. As designações de resistência são então feitas comparando a porcentagem de bactérias mortas no canal experimental com as presentes no canal de controle. Após uma hora, uma amostra com percentual de morte celular superior a 1% é considerada suscetível, enquanto menos de 0,5% de óbito é indicativo de resistência. Os percentuais que caem entre esses dois cortes são considerados indeterminados e a amostra deve ser testada novamente.

Os canais microfluidos são definidos no PDMS, que é um material de escolha para dispositivos microfluidos¹¹. O PDMS é opticamente transparente em uma ampla gama de comprimentos de onda, biocompatível, inerte, permeável aos gases e tem baixa permeabilidade aos líquidos; portanto, é bem adequado para esses experimentos.

O estresse mecânico/cisalhamento é criado pelo fluxo de mídia de temperatura ambiente sobre as bactérias imobilizadas. (Nota: Aquecer a mídia para 37 °C não tem efeito significativo no resultado do ensaio.) As bombas de seringa automatizadas forçam a mídia (contendo mancha de célula morta +/- antibiótico, bem como estressores enzimáticos opcionais) através dos canais microfluidos (200 μm x 400 μm) a uma taxa de fluxo de 1 ml/min para dar 6,25 kPa de força de cisalhamento ou uma taxa de cisalhamento de 6.000 seg^-1. Essa taxa é igual ou superior a tensões de tesoura previamente estudadas em Staphylococci.

A enzima, lysostaphin, foi selecionada para experimentos preliminares porque causa danos diretos à parede celular de Staphylococcus. A concentração de linstaphina (0,7 ng/ml) foi suficiente para causar danos na parede celular bacteriana, mas não suficiente para causar morte celular bacteriana sem antibiótico no período de tempo do experimento. A linsstalofina não é necessária para a designação correta da suscetibilidade bacteriana, mas aumenta o resultado, levando ao aumento da morte celular em cepas suscetíveis. Em contraste, o estresse de tesoura é fundamental para a função de ensaio. Quando as cepas staphylococcus aureus sensíveis à meticilina são tratadas com linstaphina e oxacilina na ausência de fluxo, nenhuma morte celular é registrada ao longo do experimento.

A viabilidade celular é monitorada com uma mancha de célula morta fluorescente¹². A seleção do corante baseou-se em sua capacidade de manchar seletivamente apenas células danificadas, sua não-celicidade para células vivas, e sua fluorescência de fundo baixo, o que permitiu sua adição direta à mídia celular sem etapas adicionais. A seleção de uma concentração de corante fluorescente de 0,25 μM foi para alcançar níveis de sinal aceitáveis durante um tempo de exposição de 1,6 segundos à luz de excitação da fluorescência.

O beta-lactam, oxacilina, foi usado em nossos estudos preliminares. As espécies S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) são resistentes à oxacilina e não apresentarão nenhuma morte celular considerável no período de tempo do experimento. A concentração de 50 μg/ml foi determinada nos estudos preliminares. As concentrações mais baixas de antibióticos deram menos separação entre cepas resistentes e suscetíveis, enquanto as concentrações mais elevadas não causaram uma diferença considerável nos desfechos experimentais.

Já relatamos anteriormente o desenvolvimento bem-sucedido de um teste que combina tensões mecânicas e enzimáticas que afetam diretamente a parede celular bacteriana¹³ com um antibiótico que inibe a biossíntese da parede celular^14,15. Esses experimentos de prova de princípio foram realizados em um painel de MRSA e S. aureus sensível à meticilina (MSSA). No entanto, com a seleção de parâmetros experimentais adequados, nosso método deve ser aplicável a múltiplas espécies de bactérias e múltiplas classes de antibióticos.

Protocolo

1. Faça a camada PDMS (Figura 1)

1. Misture vigorosamente PDMS e agente de cura em uma proporção de 10:1. Para remover bolhas, desgas a mistura viscosa em uma câmara de vácuo por 1 hora à temperatura ambiente.
2. Em uma escala, despeje o PDMS lentamente sobre o molde de alumínio. Despeje do centro e mantenha o molde nivelado. Certifique-se de deixar os pinos descobertos. Pare de derramar quando o peso-alvo for alcançado.
   Nosso molde requer 4 g de PDMS e 0,4 g de reagente de cura.
3. Nivele o molde dentro de um forno e cure a 37 °C durante a noite.
   Os tempos alternativos de cura são de 2 horas a 60 °C ou 1 hora a 90 °C.
4. Disseque a camada PDMS curada ao longo da borda do molde e retire-a cuidadosamente da superfície do molde com um par de fórceps. Limpe a superfície do molde com 70% de etanol e uma ponta Q.

2. Montar a célula de fluxo de acordo com a Figura 2

A montagem padrão de PDMS com lâminas de vidro é feita através do tratamento de plasma de oxigênio de ambas as superfícies, o que garante a ligação livre de vazamentos entre o PDMS e o deslizamento de vidro do microscópio. No protocolo apresentado, o tratamento plasmá-plasmá-lo destruiria o revestimento químico na lâmina de vidro. Portanto, o slide é selado por pressão em vez de plasma tratado.

1. Coloque a janela de vidro no bolso da célula de fluxo.
2. Coloque um deslizamento de vidro revestido sobre a janela de vidro dentro do bolso da célula de fluxo com o lado ativo para cima, e coloque a camada PDMS com canais voltados para baixo em cima dele. Coloque o slide PDMS de tal forma que as entradas do canal se alinhem com os furos na placa metálica. Empurre suavemente o ar para fora entre as camadas.
3. Vire o conjunto PDMS/vidro slide para que o PDMS fique de frente para a janela de vidro. Sobreponha as entradas do canal PDMS com os furos na placa metálica.
4. Coloque a placa de pressão por cima e aperte os parafusos.
5. Coloque a célula de fluxo montada sob o microscópio. Defina a ampliação do microscópio para 60X e pré-insinuem as posições do canal.

3. Preparar bactérias da fase de registro

1. Um dia antes do experimento: Inocula 50 ml de caldo Mueller Hinton contendo 2% de NaCl (MH2) com uma colônia bacteriana. Agite a 250 rpm durante a noite a 37 °C.
   Uma ou duas cepas bacterianas podem ser estudadas em um experimento para a configuração descrita.
2. Antes do experimento: Misture 50 μl de cultura de bactérias durante a noite em 50 ml de mídia MH2. Agite a 250 rpm por 3 horas a 37 °C para garantir que as bactérias estejam em fase de registro.

4. Aqueça os componentes da solução experimental pelo menos 10 minutos antes de serem necessários

1. Descongele o corante fluorescente (5 mM de estoque) e a linfofina (10 μg/ml de estoque) à temperatura ambiente.
2. Aqueça o pó de oxicilina à temperatura ambiente.

5. Prepare e carregue a suspensão bacteriana

1. Após o término da subcultura de 3 horas: Tome 10 ml de cultura bacteriana e centrífuga a 1.650 x g por 2 min.
2. Remova as bactérias supernaspentes e resuspendas em 1 ml de mídia MH2 fresca.
3. Conecte um curto comprimento de tubulação a uma seringa de bloqueio Luer de 1 ml. Lave a tubulação de seringa com 1 ml de mídia. Deixe um pouco de mídia na tubulação para evitar bolhas de ar ao desenhar na suspensão bacteriana.
4. Carregue 0,7 ml de bactérias tipo 1 na seringa. Preencha dois canais da célula de fluxo com bactérias tipo 1. Observe se o líquido aparecer do outro lado do canal após ca. 150 μl.
   A transparência do canal muda à medida que é preenchida com bactérias.
5. Se experimentar com vários tipos de bactérias, repita o procedimento de carregamento de bactérias tipo 2 nos dois canais restantes da célula de fluxo.
6. Coloque a célula de fluxo dentro da incubadora a 37 °C por 45 minutos para permitir a fixação e fixação bacteriana à superfície do slide.

6. Preparar e Carregar as Soluções Experimentais

1. Prepare 140 μl de solução de corante fluorescente de 0,5 mM misturando 14 μl de estoque de corante fluorescente (5 mM) e 126 μl de mídia MH2.
2. Diluir 10 mg de oxacillina em 40 ml de mídia MH2 para obter uma concentração final de 250 μg/ml oxacillin.
3. Prepare 130 ml de solução de controle com concentrações finais de corante fluorescente de 0,25 μM e 0,7 ng/ml de linstafina. Para isso, misture 65 μl de corante fluorescente (0,5 mM), 9,12 μl de caldo de lystaphin (10 μg/ml) e 130 ml de mídia MH2.
4. Prepare 130 ml de solução antibiótica com concentrações finais de corante fluorescente de 0,25 μM, 0,7 ng/ml de linfofina e 50 μg/ml de oxacilina. Para isso, misture 65 μl de corante fluorescente (0,5 mM), 9,12 μl de estoque de lysostaphin (10 μg/ml), 26 ml de oxacillina (250 μg/ml) e 104 ml de mídia MH2.
5. Encha duas seringas de 60 ml com solução de controle e duas seringas de 60 ml com solução antibiótica. Mantenha soluções embrulhadas em papel alumínio para evitar a degradação induzida pela luz dos reagentes.
   Enchimento excessivo das seringas para explicar a perda devido à descarga da tubulação.
6. Remova as bolhas de ar das seringas piscando. Conecte e encha a tubulação de entrada na ponta com a solução experimental.
7. Monte seringas na bomba. Coloque a seringa com o menor volume primeiro e, em seguida, bloqueie a posição do êmbolo. Coloque o resto das seringas na bomba, apertando seus êmbolos conforme necessário.
8. Ajuste a velocidade da bomba para 1 ml/min e o volume da bomba para 60 ml. Faça uma descarga com a bomba até que um fluxo constante de líquido seja visto de todas as seringas.

7. Configurar a célula de fluxo sob o microscópio

1. Remova a célula de fluxo da centrífuga e monte-a no estágio do microscópio(Figura 3).
2. Conecte a tubulação de entrada/saída a cada um dos canais da célula de fluxo (uma saída/uma de entrada por canal).
   A coleta de saída em quatro recipientes diferentes permite a medição de volumes individuais de saída de canal.

8. Execute o experimento de 60 minutos

1. Confira as posições pré-assinadas a partir da etapa 2.5. Se o campo de visão do microscópio não estiver centrado no canal e/ou estiver fora de foco, ajuste as configurações e salve as novas posições.
   O foco preciso pode não ser possível antes do início do fluxo devido à alta densidade de bactérias carregadas.
2. Definir o tempo de aquisição de contraste de fase para 10 msec e o tempo de aquisição da fluorescência para 1.600 msec.
3. Obtenha imagens de contraste de fase e fluorescência para cada posição antes de iniciar o fluxo.
   Isso dá uma estimativa qualitativa da densidade bacteriana carregada.
4. Inicie o fluxo líquido e verifique imediatamente se o microscópio está focado na parte inferior dos canais.
5. Faça imagens de contraste de fase e fluorescência das áreas alvo no primeiro minuto de fluxo.
6. Adquira imagens a cada 2 minutos após o primeiro conjunto de imagens até 60 minutos de fluxo ter ocorrido. Refoce-se conforme necessário.

9. Desinfetar a célula de fluxo

1. Faça uma solução de alvejante de 10% em um béquer (100 ml). Encha 4 x 20 ml de seringas com 10 ml da mistura. Depure as seringas e conecte-as à célula de fluxo.
   Levará ~1-2 min para que os canais fiquem livres de bactérias.
2. Ajuste a velocidade da bomba para 1 ml/min e o volume da bomba para 3 ml. Corra por 3 minutos.
3. Encha 4 x 60 ml de seringas com 60 ml de água DI. Depure as seringas e conecte-as à célula de fluxo.
4. Ajuste a velocidade da bomba para 1 ml/min e o volume da bomba para 30 ml. Corra por 30 min.
5. Monitore a limpeza do canal sob o microscópio.
6. Desmonte a célula de fluxo. Descarte o slide epóxi usado. Mergulhe os componentes da célula de fluxo em água DI por 20 minutos.

10. Analisar imagens e gerar dados

1. Conte o número de bactérias em cada imagem.
   O software de acesso aberto, CellProfiler é usado para realizar processamento de imagens em lote¹⁶. Um contorno de alto nível da rotina cellprofiler é resumido na Tabela 1. O número de bactérias presentes na imagem de contraste de fase (N_p) dá a contagem total de bactérias. O número de bactérias visíveis na imagem de fluorescência (N_f) dá o número de bactérias mortas.
2. Calcule a porcentagem de morte celular bacteriana normalizada em função do tempo.
   1. Importe N_f e N_p para imagens individuais no software de análise de dados.
   2. Calcule a fração de bactérias mortas em cada canal em um ponto de tempo específico dado pela fração (N_f / N_p) em t = T.
   3. Subtrair a fração de bactérias mortas presentes no início do experimento (t = 1 min) tanto para o controle quanto para os canais experimentais.
   4. Subtraia a fração de bactérias mortas presentes no canal de controle a partir do presente no canal experimental em cada ponto de tempo com a seguinte equação:
      
      
   
   
   5. Gráfico_norma DP vs. t para o curso do experimento.
      Note-se que uma amostra com um percentual de morte celular superior a 1% é considerada suscetível, enquanto menos de 0,5% de óbito é indicativo de resistência. Os percentuais que caem entre esses dois cortes são considerados indeterminados e a amostra deve ser testada novamente.
   6. Use uma planilha para resumir e analisar resultados de diferentes experimentos.

Resultados

Os dados apresentados na Figura 4 mostram a resposta de uma tensão staphylococcus aureus suscetível ao longo do tempo em um canal microfluido contendo antibióticos. As imagens de contraste de fase adquiridas em 1 min e no final do experimento de 1 hora são mostradas nas Figuras 4A e B. Os dados analisados de 1 hora são mostrados na Figura 4C com as bactérias destacadas em vermelho (5.828 no total). As imagens correspondentes de f...

Discussão

O protocolo apresentado foi validado e otimizado em um conjunto de experimentos com cepas Staphylococcus aureus sensíveis à meticilina e resistente à meticilina¹⁰. Portanto, este protocolo sem modificação deve ser diretamente aplicável a outras cepas de S. aureus e outros antibióticos com mecanismos de ação que afetam a biossíntese da parede celular bacteriana. Tipos de bactérias que não o S. aureus podem exigir variação nos parâmetros de estresse: solúvel (enzimátic...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYTOX Green	Invitrogen Corporation	S7020	Dead cell fluorescence stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, Inc	A9418-5G	Used for lysostaphin storage
Sodium Acetate	Sigma Aldrich, Inc	S8750-500G	Used for lysostaphin storage
Lysostaphin	Cell Sciences	CRL309A	Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml  lysostaphin for storage
Oxacillin salt	Sigma Aldrich, Inc	28221-1G	Antibiotic
Mueller Hinton Broth	Fisher Scientific	DF0757-17-6
Sodium chloride	Sigma Aldrixh	S3014-500G	2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving
1 ml, Luer-lock syringe	BD (Beckton, Dickinson and Comp.)	14-823-2F
2 oz, Luer-lock syringe	BD (Beckton, Dickinson and Comp.)	309653 - 60 mL	Overfill to ~65 ml
Microscope
Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70	Cambridge Scientific	9349
60X, Fluorescence/Phase contrast objective	Olympus Corp.	LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12-bit monochrome CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12-C
Microscope automation
Shutters phase contrast/fluorescence	PRIOR Scientific	H204/H202
X/Y Stage	PRIOR Scientific	H107AENN
Focus motor	PRIOR Scientific	H122
Joystick for XYZ control	PRIOR Scientific	CS152EF
Proscan Controller	PRIOR Scientific	H3-XY2
Image Acquisition Software	Fraunhofer CMI
Flow Cell Assembly and PDMS
Flow Cell	BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI	3333-1044	Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI
Glass window	Fraunhofer CMI	3333-1054	Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI
BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm	Edmund Optics Inc.	NT48-543
Sealing plate	BU Scientific Instruments Facility	3333-1045
Epoxide glass slide	Arrayit Corporation	SuperEpoxy 2
PDMS master	Fraunhofer CMI	3333-1053	Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)
PDMS slide design	Fraunhofer CMI	3333-1053
Tubing
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green	IDEX Health Science	M-644-03	Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule
Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black	IDEX Health Science	M-657
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural	IDEX Health Science	P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow	IDEX Health Science	P-259	Fits Luer-lock adapter
Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green	IDEX Health Science	1520G
Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red	IDEX Health Science	P-658